基于CRISPR/Cas9技术研究金针菇冷诱导结实基因HK1和HK2的编辑转化系统 被引量：7

1

作者 欧阳萍兰 李琼洁 +6 位作者 郭丽琼 林俊芳 叶志伟 魏韬 郑倩望 伍土恒 罗润 《食用菌学报》 CSCD 北大核心 2018年第3期1-7,107,共8页

对金针菇(Flammulina velutipes)冷诱导相关的组氨酸激酶基因HK1和HK2构建了基因组编辑(CRISPR/Cas9)pgfvs-Cas9-HK1-gRNA和pgfvs-Cas9-HK2-gRNA表达载体,探索了金针菇菌丝体及原生质体对潮霉素的最低敏感浓度,利用PEG介导的方法将表达... 对金针菇(Flammulina velutipes)冷诱导相关的组氨酸激酶基因HK1和HK2构建了基因组编辑(CRISPR/Cas9)pgfvs-Cas9-HK1-gRNA和pgfvs-Cas9-HK2-gRNA表达载体,探索了金针菇菌丝体及原生质体对潮霉素的最低敏感浓度,利用PEG介导的方法将表达载体pgfvs-Cas9-HK1/HK2-gRNA转化金针菇原生质体,经潮霉素筛选后的拟转化子再进行PCR鉴定。结果显示:金针菇菌丝体及原生质体对潮霉素的最低敏感浓度均为50μg/mL;经潮霉素筛选后的部分拟转化子成功扩增出Cas9的部分片段,携带有HK1、HK2基因载体的Cas9蛋白基因成功整合到了金针菇的基因组中,两个表达载体转化率分别为24.1%和12.5%。 展开更多

关键词 金针菇 CRISPR/Cas9 PEG介导的转化

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高产类胡萝卜素的蛹虫草液体培养基优化及其提取工艺研究 被引量：8

2

作者 殷林 林俊芳 +4 位作者 钱璟 叶志伟 罗诗华 郭丽琼 云帆 《食品工业科技》 CAS CSCD 北大核心 2017年第18期79-84,共6页

以类胡萝卜素含量为目标,采用谷物类为培养基对蛹虫草CM-03、CM-04和CM-11三株菌株进行了液体发酵培养基的优化,结果表明:三株菌株的最优培养基配方分别为CM-03:1.4 g·L^(-1)小麦、2.8 g·L^(-1)玉米、0.3 g·L^(-1)大豆、... 以类胡萝卜素含量为目标,采用谷物类为培养基对蛹虫草CM-03、CM-04和CM-11三株菌株进行了液体发酵培养基的优化,结果表明:三株菌株的最优培养基配方分别为CM-03:1.4 g·L^(-1)小麦、2.8 g·L^(-1)玉米、0.3 g·L^(-1)大豆、0.1 g·L^(-1)MgSO_4·7H_2O、0.1 g·L^(-1)KH_2PO_4、0.05 mg·L^(-1)VB_1、pH自然,类胡萝卜素含量为(694.8±15.4)μg/g;CM-04:1.2 g·L^(-1)大米、0.6 g·L^(-1)玉米、0.3 g·L^(-1)大豆,0.1 g·L^(-1)MgSO_4·7H_2O、0.1 g·L^(-1)KH_2PO_4、0.05 mg·L^(-1)VB_1、pH自然,类胡萝卜素含量为(708.5±25.8)μg/g;CM-11:1.7 g·L^(-1)小麦、2.6 g·L^(-1)玉米、0.3 g·L^(-1)大豆,0.1 g·L^(-1)MgSO_4·7H_2O、0.1 g·L^(-1)KH_2PO_4、0.05 mg·L^(-1)VB_1、pH自然,类胡萝卜素含量为(700.5±19.1)μg/g。同时,使用乙醇提取法对类胡萝卜素提取工艺进行了优化,结果表明乙醇提取法的最佳工艺条件为:采用石英砂研磨破壁,乙醇浓度60%、料液比1∶40,水浴提取温度80℃,提取级数2级,提取率达到92.8%。 展开更多

关键词 蛹虫草 类胡萝卜素 液体发酵 培养基 提取

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带鱼肠道中芽孢杆菌的分离鉴定及其发酵液抗菌性质研究 被引量：11

3

作者 许本宏 林俊芳 +3 位作者 叶志伟 郭丽琼 陆雅琴 林金德 《水产科学》 CAS CSCD 北大核心 2018年第2期193-200,共8页

从带鱼肠道中分离筛选到1株具有广谱抗菌活性的菌株JFL15,其发酵液对嗜水气单胞菌、美人鱼发光杆菌、哈维氏弧菌、溶藻弧菌、大肠杆菌、迟钝爱德华氏菌、铜绿假单胞菌、副溶血弧菌、创伤弧菌、查氏弧菌均有较强抑菌作用。通过形态特征... 从带鱼肠道中分离筛选到1株具有广谱抗菌活性的菌株JFL15,其发酵液对嗜水气单胞菌、美人鱼发光杆菌、哈维氏弧菌、溶藻弧菌、大肠杆菌、迟钝爱德华氏菌、铜绿假单胞菌、副溶血弧菌、创伤弧菌、查氏弧菌均有较强抑菌作用。通过形态特征、生理生化特征、16S rDNA序列分析以及系统发育进化分析,菌株JFL15与暹罗芽孢杆菌的同源性最高,达98.05%,初步鉴定为暹罗芽孢杆菌。对暹罗芽孢杆菌JFL15的发酵液进行研究发现,暹罗芽孢杆菌JFL15的发酵液对酶、温度、酸碱度和紫外线均不敏感,且发酵产物储存较长时间后仍具有较强抑菌活性。 展开更多

关键词 分离鉴定 JFL15菌株 水产病原菌 抗菌活性 稳定性

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北冬虫夏草角鲨烯单氧酶基因的类胡萝卜素生物合成功能解析 被引量：1

4

作者 赵逸 陈海盈 +4 位作者 李舒丽 许玮竣 郭丽琼 林俊芳 叶志伟 《现代食品科技》 CAS 北大核心 2021年第9期37-42,278,共7页

以转录组数据为依据推测北冬虫夏草erg1基因可能参与其类胡萝卜素合成过程,进一步检测和分析erg1基因在添加不同胁迫因子高锰酸钾和氯化钠之后mRNA的相对表达量,探究其在类胡萝卜素合成途径中的调控作用。为了验证erg1基因的功能,该论... 以转录组数据为依据推测北冬虫夏草erg1基因可能参与其类胡萝卜素合成过程,进一步检测和分析erg1基因在添加不同胁迫因子高锰酸钾和氯化钠之后mRNA的相对表达量,探究其在类胡萝卜素合成途径中的调控作用。为了验证erg1基因的功能,该论文构建了erg1基因过表达载体pCambia0390-blpR-Pcmgpd-erg1,通过根瘤农杆菌侵染北冬虫夏草孢子的方式将erg1基因表达框导入北冬虫夏草基因组中,测定类胡萝卜素生物合成量及erg1基因的表达水平。结果表明,高锰酸钾(氧化)和氯化钠(渗透)胁迫下的重组Cmerg1菌株的类胡萝卜素产量分别为6757.17μg/g和6363.93μg/g,依次是对照组的1.22倍和1.20倍。因此,erg1基因的过表达引起了北冬虫夏草Cmerg1菌株的类胡萝卜素累积能力的提升,也即说明角鲨烯单氧酶基因参与北冬虫夏草类胡萝卜素的合成过程。研究结果为北冬虫夏草类胡萝卜素生物合成的研究和利用奠定了实验基础。 展开更多

关键词 北冬虫夏草 角鲨烯单氧酶 过表达 转录调控

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三种诱导物对金针菇子实体产量及部分化学成分含量的影响 被引量：2

5

作者 伍土恒 白伟芳 +1 位作者 林俊芳 郭丽琼 《食用菌学报》 CSCD 北大核心 2017年第4期33-38,共6页

研究壳聚糖、2,4-二氯苯氧乙酸及三十烷醇对金针菇(Flammulina velutipes)的原基分化时间、子实体产量以及部分化学成分含量的影响。结果表明,实验浓度内3种诱导物均可显著缩短原基分化时间,与对照组相比,处理浓度为1、2mg/kg的壳聚糖... 研究壳聚糖、2,4-二氯苯氧乙酸及三十烷醇对金针菇(Flammulina velutipes)的原基分化时间、子实体产量以及部分化学成分含量的影响。结果表明,实验浓度内3种诱导物均可显著缩短原基分化时间,与对照组相比,处理浓度为1、2mg/kg的壳聚糖使原基分化时间缩短3d。除0.5mg/kg壳聚糖、1mg/kg 2,4-二氯苯氧乙酸和0.5mg/kg三十烷醇外,其余浓度的3种诱导物均可显著增加金针菇子实体产量。其中2,4-二氯苯氧乙酸的浓度为0.05 mg/kg时,金针菇子实体产量达到最大值(57.15±1.72)g。壳聚糖浓度为0.05mg/kg时,子实体的蛋白质含量最高,为(39.73±0.05)mg/g;当壳聚糖浓度为0.5mg/kg时,子实体的总黄酮、总多酚和花色苷含量最高,分别为(50.55±0.02)、(2.15±0.01)mg/g和(51.34±0.29)μg/g。三种诱导物中,1mg/kg壳聚糖显著增加金针菇甘露醇含量,为(57.20±0.02)mg/g。0.5mg/kg的2,4-二氯苯氧乙酸处理的金针菇子实体总多糖含量达到最高(12.43±0.05)μg/g。 展开更多

关键词 金针菇 壳聚糖 三十烷醇 2 4-二氯苯氧乙酸

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蛹虫草类胡萝卜素双加氧裂解酶基因的克隆及表达分析 被引量：1

6

作者 李栋 林俊芳 +4 位作者 刘聪 叶志伟 郭丽琼 云帆 康林芝 《中国食品学报》 EI CAS CSCD 北大核心 2019年第7期215-220,共6页

目的:类胡萝卜素双加氧裂解酶(CCD)是类胡萝卜素生物合成途径中的一个关键酶。旨在鉴定并克隆蛹虫草中的CCD酶,通过相关生物信息学分析和荧光定量PCR探究其结构、功能聚类以及表达调控。方法:用GenBank登录的CCD酶基因序列与蛹虫草基因... 目的:类胡萝卜素双加氧裂解酶(CCD)是类胡萝卜素生物合成途径中的一个关键酶。旨在鉴定并克隆蛹虫草中的CCD酶,通过相关生物信息学分析和荧光定量PCR探究其结构、功能聚类以及表达调控。方法:用GenBank登录的CCD酶基因序列与蛹虫草基因组比对,在保守区域设计1对引物,以蛹虫草基因组的DNA为模板对CCD酶基因进行扩增,扩增产物命名为car-TC。car-TC基因连接载体后由生物公司测序;序列通过多种生物信息学软件和在线工具分析;表达量随生长情况的变化关系通过实时荧光定量PCR进行测定。结果:克隆了car-TC基因,该基因长1784bp,编码一个577aa的蛋白质,该蛋白质含有CCD酶活性必需的4个组氨酸残基,系统发育进化分析表明该蛋白和棒束菌、白僵菌的同源蛋白聚在同一簇,实时荧光定量PCR结果表明该蛋白的表达量随生长时间的延长而减少。结论:获得一个类胡萝卜素合成途径中的关键酶——双加氧裂解酶基因car-TC,该基因的表达主要受时序调控,随生活周期的进行有逐渐降低的趋势。 展开更多

关键词 蛹虫草 类胡萝卜素 类胡萝卜素双加氧裂解酶 生物信息学分析 实时荧光PCR

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芽孢杆菌P6产抗菌脂肽条件优化及发酵液性质研究 被引量：4

7

作者 陆雅琴 郭丽琼 +3 位作者 孙丽仪 林俊芳 许本宏 刘英丽 《中国食品学报》 EI CAS CSCD 北大核心 2018年第11期90-96,共7页

目的:提高芽孢杆菌P6发酵产抗菌脂肽的水平,探究其应用潜力。方法:考察时间、温度、培养基起始pH、转速、接种量、装液量这6个因素对供试菌株产抑菌活性物质的影响,考察发酵液的温度、紫外照射、酸碱稳定性。结果:菌株P6生产抗菌脂肽的... 目的:提高芽孢杆菌P6发酵产抗菌脂肽的水平,探究其应用潜力。方法:考察时间、温度、培养基起始pH、转速、接种量、装液量这6个因素对供试菌株产抑菌活性物质的影响,考察发酵液的温度、紫外照射、酸碱稳定性。结果:菌株P6生产抗菌脂肽的最佳发酵条件为:温度30℃,培养基初始pH天然,装液量100 mL/250mL,接种量1%,转速130 r/min,发酵时间60 h。发酵上清液能够耐100℃高温,pH耐受范围3～9,紫外照射3 h后活性仍保持50%以上。抑菌谱试验结果表明,发酵液对15种水产致病菌均有抑菌活力。结论:优化后抑菌圈直径比优化前提高了54%,且菌株P6产生的抗菌物质具有良好的稳定性和广谱性,有很大的应用潜力。 展开更多

关键词 抗菌脂肽 发酵优化 水产病原菌 稳定性

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植物乳杆菌α-葡萄糖基转移酶基因挖掘及表达研究

8

作者 谢露 郭丽琼 +2 位作者 林俊芳 叶志伟 钟倩婷 《现代食品科技》 EI CAS 北大核心 2017年第2期94-98,共5页

α-葡萄糖基转移酶(α-GTF)是一类可以利用麦芽糖,异麦芽糖,O-甲基葡萄糖苷等为底物合成低聚糖的多功能性酶,因其功能多样性和独特性而备受关注。本文利用本团队测序的植物乳杆菌(FMNP01)全基因组信息,采用生物信息学方法分析获得α-葡... α-葡萄糖基转移酶(α-GTF)是一类可以利用麦芽糖,异麦芽糖,O-甲基葡萄糖苷等为底物合成低聚糖的多功能性酶,因其功能多样性和独特性而备受关注。本文利用本团队测序的植物乳杆菌(FMNP01)全基因组信息,采用生物信息学方法分析获得α-葡萄糖基转移酶基因(α-gtf),同时根据NCBI中上传的乳酸菌全基因组信息中的α-GTF的DNA序列设计引物,利用PCR技术分别从植物乳杆菌、干酪乳杆菌和短乳杆菌中克隆得到3个α-gtf基因,其编码的氨基酸序列相似性分别为42%、29%和29%;将克隆得到的3个基因分别与表达载体pET-32a连接构建成表达质粒,转入大肠杆菌BL21表达宿主菌中进行诱导表达,产物经SDS-PAGE分析表明,在75 ku处都有一明显条带,与预期蛋白分子量一致,表明这3个基因成功获得了表达。同时对诱导剂浓度、诱导时间和温度进行优化,可望为以后相关研究奠定了基础。 展开更多

关键词 乳酸菌 α-葡萄糖基转移酶 基因挖掘 原核表达

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从头合成赤松素大肠杆菌工程菌的构建

9

作者 梁景龙 郭丽琼 +2 位作者 林俊芳 蔡法及 陆雅琴 《现代食品科技》 EI CAS 北大核心 2017年第3期74-80,共7页

赤松素是高价值芪类保健营养品白藜芦醇的类似物,具有预防心血管疾病、抗癌和治疗关节炎等与其相对应的多种生物活性。本研究采用基因工程手段创制出一种从头生物合成赤松素的方法,以缓解目前赤松素供求不足的问题。把带有苯丙氨酸解氨... 赤松素是高价值芪类保健营养品白藜芦醇的类似物,具有预防心血管疾病、抗癌和治疗关节炎等与其相对应的多种生物活性。本研究采用基因工程手段创制出一种从头生物合成赤松素的方法,以缓解目前赤松素供求不足的问题。把带有苯丙氨酸解氨酶(PAL),肉桂酸辅酶A连接酶(4CL)和赤松素合酶(STS)编码基因的组成型表达载体转化高产L-苯丙氨酸大肠杆菌ATCC31884,并通过PCR鉴定后,获得重组工程菌株。工程菌进行摇瓶培养,对培养液进行高效液相色谱检测,确定工程菌具有生物合成赤松素的能力。随后通过对工程菌在不同培养时间产物生成量的比较,结果表明,赤松素在发酵12 h后增长缓慢,24 h培养液中的赤松素含量最高,为0.32 mg/L,而其中间体肉桂酸的积累最高达到52.92 mg/L。这表明,大肠杆菌工程菌能在不添加任何前体物的情况下,利用自身代谢从头合成赤松素,但中间体肉桂酸的转化能力不足,有待下一步实验进行改善。 展开更多

关键词 赤松素 大肠杆菌 从头合成

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芒果源植物乳杆菌FMNP01的全基因组测序及序列分析 被引量：7

10

作者 李雪飞 郭丽琼 +2 位作者 叶志伟 刘英丽 林俊芳 《中国食品学报》 EI CAS CSCD 北大核心 2018年第5期232-238,共7页

目的:植物乳杆菌FMNP01是从新鲜热带芒果中分离获得的一株具有较好抗菌活性的乳酸菌。为深入研究其内在抗菌机理,对其进行全基因组测序并解析基因组序列信息。方法:采用高通量测序技术对植物乳杆菌FMNP01进行全基因组测序,采用生物信息... 目的:植物乳杆菌FMNP01是从新鲜热带芒果中分离获得的一株具有较好抗菌活性的乳酸菌。为深入研究其内在抗菌机理,对其进行全基因组测序并解析基因组序列信息。方法:采用高通量测序技术对植物乳杆菌FMNP01进行全基因组测序,采用生物信息学方法对其进行序列组装、基因预测与功能注释,并深入挖掘其细菌素合成相关基因簇信息。结果:通过基因组组装共得到18个重叠群,整个基因组大小为3 313 644 bp,GC含量44.48%。将序列提交至Gen Bank数据库,登陆号为JPSU00000000。在其基因组中发现一段细菌素合成相关基因簇。结论:本研究结果揭示了植物乳杆菌FMNP01抑菌机理,为其功能基因组学研究提供了理论依据。 展开更多

关键词 植物乳杆菌 全基因组测序 抗菌活性

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杏鲍菇中土著益生菌的筛选与鉴定 被引量：2

11

作者 熊荣园 林俊芳 +2 位作者 叶志伟 刘英丽 郭丽琼 《中国食品学报》 EI CAS CSCD 北大核心 2016年第5期217-223,共7页

以杏鲍菇的表皮为材料,通过添加溴甲酚紫的MRS培养基分离得到56株土著菌。以降解亚硝酸盐和降胆固醇的综合能力为指标进行复筛,得到4株土著益生菌。对这4株菌进行耐酸和耐胆盐的模拟试验,得到1株降亚硝酸盐和胆固醇综合能力较强以及耐... 以杏鲍菇的表皮为材料,通过添加溴甲酚紫的MRS培养基分离得到56株土著菌。以降解亚硝酸盐和降胆固醇的综合能力为指标进行复筛,得到4株土著益生菌。对这4株菌进行耐酸和耐胆盐的模拟试验,得到1株降亚硝酸盐和胆固醇综合能力较强以及耐胆盐能力较强的菌株C3。通过生理生化试验和16Sr DNA鉴定,确定其为乳酸乳球菌。 展开更多

关键词 杏鲍菇 土著益生菌 亚硝酸盐 胆固醇

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米曲霉中蓝藻抗病毒蛋白-N基因的克隆与表达

12

作者 谢露 付显令 +4 位作者 孙萍 林俊芳 郭丽琼 云帆 黎倩怡 《生物技术》 CAS CSCD 北大核心 2016年第2期126-129,157,共5页

[目的]提高蓝藻抗病毒蛋白-N(CVN)的异源表达量,获得大量高纯度可溶性蛋白。[方法]采用RT-PCR从酱油发酵酱醪宏基因组中克隆获得CVN基因cvn-SF,构建了重组表达载体p ET32a-cvn-SF,转化E.coli BL21菌株,获得工程菌株,优化表达条件,通过Ni... [目的]提高蓝藻抗病毒蛋白-N(CVN)的异源表达量,获得大量高纯度可溶性蛋白。[方法]采用RT-PCR从酱油发酵酱醪宏基因组中克隆获得CVN基因cvn-SF,构建了重组表达载体p ET32a-cvn-SF,转化E.coli BL21菌株,获得工程菌株,优化表达条件,通过Ni-NTA凝胶亲和层析对CVN-SF蛋白进行纯化。[结果]工程菌株在温度30℃、添加1 mmol/L的IPTG诱导剂、培养时间12 h的条件下获得最高表达量的可溶性蛋白。Ni-NTA凝胶亲和层析纯化得到了230.8 mg/L的CVN蛋白,占提取总蛋白含量的33.37%。[结论]所得CVN蛋白高于目前报道的CVN在大肠杆菌的最高表达量140 mg/L^([11])。 展开更多

关键词 蓝藻抗病毒蛋白-N 酱醪 米曲霉 基因克隆 基因表达

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