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稳定表达猪德尔塔冠状病毒N蛋白的Vero细胞系的建立及鉴定 被引量：1
1
作者 钱炳旭 薄宗义 +7 位作者 白雪雁 张成成 郭梦娇 李梦娇 廖凯 薛峰 吴艳涛 张小荣 《中国动物传染病学报》 CAS 北大核心 2024年第1期56-61,共6页
为获得稳定表达猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)核衣壳(N)蛋白的非洲绿猴肾(Vero)细胞系,本研究将PDCoV-N基因克隆入慢病毒载体中,获得重组质粒pLVX-PDCoV-N,利用慢病毒包装系统转染293T细胞,包装成表达N蛋白的慢病毒颗粒,慢病毒感染Vero细胞,... 为获得稳定表达猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)核衣壳(N)蛋白的非洲绿猴肾(Vero)细胞系,本研究将PDCoV-N基因克隆入慢病毒载体中,获得重组质粒pLVX-PDCoV-N,利用慢病毒包装系统转染293T细胞,包装成表达N蛋白的慢病毒颗粒,慢病毒感染Vero细胞,嘌呤霉素加压筛选目的细胞。RT-PCR扩增N基因和测序表明细胞系基因组中存在N蛋白编码序列,Western blot和IFA试验表明N蛋白可在细胞系中稳定表达。应用制备的细胞系对临床PDCoV阳性血清样品进行检测,与ELISA检测结果符合率达到100%。本研究成功建立了稳定表达PDCoV N蛋白的Vero细胞系,为PDCoV N蛋白生物学特性研究和PDCoV的临床检测、流行病学调查奠定了基础。 展开更多
关键词 猪德尔塔冠状病毒 核衣壳(N)蛋白 慢病毒 稳转细胞系
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不同贮藏温度下进口生鲜牛肉中大肠杆菌生长预测模型的建立 被引量：6
2
作者 陈雨 梁莹 +7 位作者 周萍萍 任建鸾 杨捷琳 郭德华 薛峰 蒋原 汤芳 戴建君 《食品工业科技》 CAS 北大核心 2021年第12期81-88,共8页
为了建立不同温度条件下进口生鲜牛肉中大肠杆菌O157:H7的生长预测模型。将于超市购买的进口生鲜牛肉和大肠杆菌O157:H7作为研究对象,监测其在4、16、25、30、37℃贮藏温度条件下进口生鲜牛肉中大肠杆菌生长数据,绘制生长曲线,采用修正G... 为了建立不同温度条件下进口生鲜牛肉中大肠杆菌O157:H7的生长预测模型。将于超市购买的进口生鲜牛肉和大肠杆菌O157:H7作为研究对象,监测其在4、16、25、30、37℃贮藏温度条件下进口生鲜牛肉中大肠杆菌生长数据,绘制生长曲线,采用修正Gompertz、Logistic、Richards、MMF四种模型进行拟合,建立进口生鲜牛肉中大肠杆菌一级模型,将一级模型拟合的数据代入Ratkowsky方程建立二级模型,通过准确因子、偏差因子以及均方根误差,对模型的准确性进行检验。结果表明,四种模型拟合后得到的相关系数均为0.98以上,修正Gompertz模型数据表明该模型拟合程度最好,最适合预测大肠杆菌在进口生鲜牛肉上的生长动态,模型的准确因子均为0.99,偏差因子为1.14和1.03,决定系数R~2为0.97和0.99,说明所建立的模型可靠性较高。本研究建立的生长预测模型能够有效预测4~37℃不同温度条件下大肠杆菌O157:H7在进口生鲜牛肉上的生长情况。 展开更多
关键词 大肠杆菌O157:H7 进口 生鲜牛肉 贮藏温度 生长预测模型
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一种快速鉴别牛肉中大肠杆菌O157:H7检测方法的建立及应用 被引量：4
3
作者 赵亚男 曾德新 +7 位作者 郭德华 蒋原 蒋鲁岩 李鑫妮 陈伟 汤芳 薛峰 戴建君 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2020年第4期272-279,296,共9页
目的建立一种快速、准确检测牛肉中大肠杆菌O157∶H7的方法。方法利用抗大肠杆菌O157∶H7单克隆抗体2G5(捕获抗体),酶标单克隆抗体2E3(HRP-2E3,检测抗体),建立可用于检测大肠杆菌O157∶H7的双抗体夹心ELISA方法,同时对反应条件进行优化... 目的建立一种快速、准确检测牛肉中大肠杆菌O157∶H7的方法。方法利用抗大肠杆菌O157∶H7单克隆抗体2G5(捕获抗体),酶标单克隆抗体2E3(HRP-2E3,检测抗体),建立可用于检测大肠杆菌O157∶H7的双抗体夹心ELISA方法,同时对反应条件进行优化并对该方法进行评价。结果通过优化得到最佳反应条件,单克隆抗体2G5最佳包被浓度为4.48μg/mL,HRP-2E3最佳检测浓度为19.9μg/mL。该方法对纯培养菌液最低检出限为1×10^5 CFU/mL,具有良好的敏感性,且特异性良好,与其他大肠杆菌、沙门氏菌、李斯特菌等均无交叉反应。板内及板间变异系数均小于7%,具有较高的精密度。人工污染牛肉样品增菌8 h后,对大肠杆菌O157∶H7的检出限为1 CFU/25 g。结论建立的双抗体夹心ELISA检测方法灵敏度、准确度、重复性良好,特异性强,可用于临床实际样品检测。 展开更多
关键词 大肠杆菌O157∶H7 双抗体夹心ELISA 单克隆抗体 牛肉
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市售蜂蜜中残留细菌的分离与鉴定 被引量：1
4
作者 曾德新 厉蓉蓉 +5 位作者 张娜 封振 许蔚 张锐 周俊 蒋鲁岩 《美食研究》 北大核心 2021年第3期75-81,共7页
从南京市筛选92份菌落总数测定值>10 CFU/g的蜂蜜样品进行菌种分析,以了解市售蜂蜜样品中主要残留菌;参考我国蜂蜜生产工艺,对蜂蜜中主要残留菌设计50~121℃的热处理评价实验,以了解目前主流生产工艺对蜂蜜中主要残留菌的消杀效果及... 从南京市筛选92份菌落总数测定值>10 CFU/g的蜂蜜样品进行菌种分析,以了解市售蜂蜜样品中主要残留菌;参考我国蜂蜜生产工艺,对蜂蜜中主要残留菌设计50~121℃的热处理评价实验,以了解目前主流生产工艺对蜂蜜中主要残留菌的消杀效果及主要残留菌的完全致死温度。结果表明:市售蜂蜜中主要残留菌种为蜡样芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌,其分离率分别为71%和24%;热处理评价试验表明,主流生产工艺无法完全灭活蜂蜜中主要残留菌,50℃处理30 min,蜡样芽孢杆菌灭活率为87.88%,枯草芽孢杆菌灭活率为80.32%,当温度大于100℃时可使上述两种菌完全灭活。 展开更多
关键词 蜂蜜 残留细菌 分离 鉴定
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非洲猪瘟病毒实时荧光RAA检测方法的建立 被引量：18
5
作者 赵凯颖 曾德新 +5 位作者 胡永新 钱炳旭 薛峰 钱莺娟 吴晓东 戴建君 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2021年第1期1-8,共8页
为了建立非洲猪瘟病毒(ASFV)简捷、高效的基层临床检测方法,本研究选取非洲猪瘟病毒保守基因B646L(P72)序列,设计特异性引物和探针,建立非洲猪瘟病毒实时荧光重组酶介导等温扩增(RAA)检测方法。结果显示,所建立方法与OIE推荐的荧光定量... 为了建立非洲猪瘟病毒(ASFV)简捷、高效的基层临床检测方法,本研究选取非洲猪瘟病毒保守基因B646L(P72)序列,设计特异性引物和探针,建立非洲猪瘟病毒实时荧光重组酶介导等温扩增(RAA)检测方法。结果显示,所建立方法与OIE推荐的荧光定量PCR方法灵敏度相当,低至10 copies,μL,检测时长仅需10 min,与口蹄疫病毒(FMDV)、猪细小病毒(PPV)、伪狂犬病病毒(PRV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)均无交叉反应。对100份临床样品的检测结果与OIE推荐的荧光定量PCR结果一致,但相较于荧光定量PCR检测时间的2h,检测时间大大缩短。结果表明,本研究建立的方法灵敏度较高、特异性较好,为ASFV早期临床诊断提供了技术支持。 展开更多
关键词 非洲猪瘟病毒 重组酶介导等温扩增方法 检测
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奶牛乳房炎四种致病菌PCR核酸免疫层析试纸条快速检测方法的建立及应用 被引量：11
6
作者 陈诗胜 张正荣 +5 位作者 任建鸾 曾德新 薛峰 蒋原 郭德华 戴建君 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2020年第3期283-293,共11页
为了开发检测导致奶牛乳房炎的无乳链球菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和停乳链球菌这四种重要致病菌的PCR核酸免疫层析试纸条方法,本研究采用柠檬酸还原法制备10 nm的胶体金溶液,选用优化的10μL 1 mol/L碳酸钾溶液调节pH和5μL异硫氰... 为了开发检测导致奶牛乳房炎的无乳链球菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和停乳链球菌这四种重要致病菌的PCR核酸免疫层析试纸条方法,本研究采用柠檬酸还原法制备10 nm的胶体金溶液,选用优化的10μL 1 mol/L碳酸钾溶液调节pH和5μL异硫氰酸荧光素抗体偶联金颗粒,并使用优化的封闭液(10%BSA、0.25%PEG2000、0.05%吐温-20、0.05%Triton-X100)进行封闭,将地高辛抗体和山羊抗鼠二抗分别喷涂在检测线和质控线上,烘干并组装成试纸条,进行细菌的纯培养物和鲜牛奶加样检测。结果显示,所制备的PCR核酸免疫层析试纸条和凝胶电泳均具有较好的特异性,最低检测限要比凝胶电泳高10倍,在模拟污染牛奶样品测试中,试纸条仍然具有很好的特异性且灵敏度比凝胶电泳的高。上述结果表明,本研究建立的PCR核酸免疫层析试纸条检测方法具有良好的临床应用潜力。 展开更多
关键词 奶牛乳房炎 PCR 胶体金 检测
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猪德尔塔冠状病毒抗体间接ELISA检测方法的建立及初步应用 被引量：5
7
作者 钱炳旭 白雪雁 +6 位作者 张成成 郭梦娇 李梦娇 廖凯 薛峰 吴艳涛 张小荣 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2021年第7期1234-1241,共8页
通过DNAStar Protean软件对猪德尔塔冠状病毒(porcine Deltacoronavirus,PDCoV)N蛋白氨基酸序列进行分析,选取抗原性较强的区段(265~342 aa),根据大肠杆菌密码子使用的偏嗜性进行优化设计并人工合成了对应的基因片段N-Opti。利用融合表... 通过DNAStar Protean软件对猪德尔塔冠状病毒(porcine Deltacoronavirus,PDCoV)N蛋白氨基酸序列进行分析,选取抗原性较强的区段(265~342 aa),根据大肠杆菌密码子使用的偏嗜性进行优化设计并人工合成了对应的基因片段N-Opti。利用融合表达载体pET-32a进行原核表达,获得的融合蛋白携带His标签,命名为PDCoV-N-His,且呈可溶性表达。Western blot鉴定结果显示,该重组N蛋白约为31 kDa,与预期相符。利用Ni-NTA亲和层析介质纯化重组N蛋白作为包被抗原进行ELISA检测,并对反应条件进行摸索、优化,建立了检测PDCoV特异性抗体的间接ELISA方法。经测定,该方法具有良好的特异性且重复性良好,与猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)和猪轮状病毒(PRoV)特异性阳性血清无交叉反应,批内和批间重复性试验的变异系数均小于10%。应用该方法对20份已知阳性血清和20份阴性血清分别进行检测,结果显示阳性符合率为100%(20/20),阴性符合率为100%(20/20)。结果表明,该方法的特异性良好,可以进一步用于PDCoV感染的快速诊断和流行病学调查。 展开更多
关键词 猪德尔塔冠状病毒 核衣壳(N)蛋白 原核表达 间接ELISA
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牛奶淀粉样蛋白A的原核表达及单克隆抗体制备
8
作者 张正荣 郭晨瑶 +5 位作者 陈诗胜 赵亚男 任建鸾 汤芳 薛峰 戴建君 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2021年第6期1111-1117,共7页
牛奶中血清淀粉样蛋白A(MAA)是表征奶牛乳腺炎的重要生物标志物,本研究构建了携带MAA基因的重组原核表达质粒pET28a-SUMO-MAA,采用大肠杆菌BL21(DE3)作为表达菌株,IPTG诱导表达,获得可溶性重组蛋白SUMO-MAA,用特异性SUMO酶切除重组蛋白... 牛奶中血清淀粉样蛋白A(MAA)是表征奶牛乳腺炎的重要生物标志物,本研究构建了携带MAA基因的重组原核表达质粒pET28a-SUMO-MAA,采用大肠杆菌BL21(DE3)作为表达菌株,IPTG诱导表达,获得可溶性重组蛋白SUMO-MAA,用特异性SUMO酶切除重组蛋白上的SUMO标签后通过亲和层析纯化获得MAA。用纯化后的MAA免疫BALB/c小鼠,制备抗MAA的单克隆抗体并测定其效价和特异性。结果显示,本研究成功表达可溶性MAA蛋白,大小约为17 kDa,筛选出2株单抗均可与MAA蛋白反应,效价分别为1∶25600,1:51200。试验为后续开发牛奶中血清淀粉样蛋白的检测方法以及奶牛乳腺炎的诊断研究奠定重要基础。 展开更多
关键词 奶牛乳腺炎 牛奶中血清淀粉样蛋白A 原核表达 单克隆抗体
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