转ARL-1基因HepG2细胞耐药相关基因的筛选 被引量：5

1

作者 杨向东 唐大年 +1 位作者 王建 曹德良 《癌症》 SCIE CAS CSCD 北大核心 2003年第12期1289-1295,共7页

背景与目的:醛糖还原酶相似基因1(aldose-reductaselikegene-1,ARL-1)在原发性肝癌中高表达,与肝癌细胞对化疗药物耐药有关。本研究拟建立转染ARL-1的人肝癌细胞株,观察转染ARL-1的HepG2细胞对含醛基抗肿瘤药物耐药性的改变,利用基因表... 背景与目的:醛糖还原酶相似基因1(aldose-reductaselikegene-1,ARL-1)在原发性肝癌中高表达,与肝癌细胞对化疗药物耐药有关。本研究拟建立转染ARL-1的人肝癌细胞株,观察转染ARL-1的HepG2细胞对含醛基抗肿瘤药物耐药性的改变,利用基因表达谱芯片筛选HepG2细胞转染ARL-1后差异表达耐药相关基因。方法:采用脂质体转染PBK/ARL-1质粒到HepG2细胞,获得高表达ARL-1的单克隆细胞株;RT-PCR、流式免疫荧光和免疫组化鉴定高表达ARL-1的HepG2细胞;应用MTT法和细胞凋亡分析研究HepG2细胞和转染ARL-1的HepG2细胞对含醛基抗肿瘤药物阿霉素(ADM)和丝裂霉素(MMC)的耐药性,以5-氟尿嘧啶(5-FU)(不含醛基)为对照;将Cy3和Cy5两种荧光染料分别标记两种细胞的cDNA探针,与人肝癌基因表达谱芯片进行杂交与扫描,观察转染ARL-1基因HepG2与对照组HepG2细胞在基因表达谱方面的差异,筛选耐药相关基因,并运用RT-PCR和Westernblot对部分差异表达相关基因进行初步证实。结果:与对照组HepG2细胞相比,转染ARL-1基因HepG2细胞高表达ARL-1蛋白,明显增强对含醛基的抗肿瘤药物如ADM、MMC的耐药性,分别提高2.6倍和3.47倍,用5-FU处理两组细胞,则未发现有明显的耐药差异(ADM组t=6.39,P<0.05;MMC组t=30.06,P<0.01;5-FU组t=0.684,P>0.05);芯片扫描结? 展开更多

关键词 转ARL-1基因 HEPG2 相关基因 筛选 耐药性 肝癌 癌细胞

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蛋白酶体抑制剂MG132诱导HepG2细胞凋亡及其机制研究 被引量：4

2

作者 何慧 郭芳 +3 位作者 屈顺林 任重 刘俊文 杨向东 《中国药理学通报》 CAS CSCD 北大核心 2005年第7期795-798,共4页

目的观察蛋白酶体抑制剂MG132对人肝癌细胞HepG2的致凋亡作用,并从泛素蛋白酶体途径(UPP)相关基因E1、E2和E3及天冬氨酸特异的半胱氨酸蛋白酶3(Caspase3)表达初步探讨MG132的致细胞凋亡机制。方法采用多个浓度(2、5、10μmol·L-1)... 目的观察蛋白酶体抑制剂MG132对人肝癌细胞HepG2的致凋亡作用,并从泛素蛋白酶体途径(UPP)相关基因E1、E2和E3及天冬氨酸特异的半胱氨酸蛋白酶3(Caspase3)表达初步探讨MG132的致细胞凋亡机制。方法采用多个浓度(2、5、10μmol·L-1)的蛋白酶体抑制剂MG132处理HepG2细胞;流式细胞术检测细胞周期和细胞凋亡率,DNA琼脂糖凝胶电泳检测细胞凋亡;逆转录聚合酶链反应(RTPCR)检测UPP相关基因E1、E2、E3和凋亡相关基因Caspase3的转录水平;免疫细胞化学检测Caspase3蛋白表达。结果对照组HepG2细胞凋亡率低于5%,在2、5和10μmol·L-1MG132作用下,细胞凋亡率分别为42.9%、66.1%、72.8%,MG132诱导HepG2细胞凋亡具有量效关系;RTPCR检测发现细胞内UPP相关基因E1、E2、E3mRNA表达下降,而凋亡相关基因Caspase3mRNA表达上调;免疫组化检测Caspase3蛋白表达水平升高。结论蛋白酶体抑制剂MG132能够诱导HepG2细胞凋亡,其机制可能与MG132抑制UPP活性,使细胞内Caspase3蛋白降解减少,同时上调Caspase3基因转录,促进细胞凋亡。 展开更多

关键词 泛素-蛋白酶体途径 蛋白酶体抑制剂 肝癌细胞 凋亡 CASPASE-3

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苦瓜素对柯萨奇B_3病毒核糖核酸的作用及其机制 被引量：10

3

作者 李双杰 王佐 +3 位作者 邓晖 万腊香 吴孟津 张宝林 《实用儿科临床杂志》 CAS CSCD 北大核心 2004年第7期548-550,共3页

目的　观察苦瓜素对急性柯萨奇B3 病毒 (CVB3 )心肌炎心肌中CVB3 RNA量的影响 ,并对苦瓜素的抗病毒机制及其与干扰素 (INF)的关系进行探讨。方法　以CVB3 感染Balb/C小鼠建立病毒性心肌炎实验模型 ,随机分为苦瓜素处理组和生理盐水对照... 目的　观察苦瓜素对急性柯萨奇B3 病毒 (CVB3 )心肌炎心肌中CVB3 RNA量的影响 ,并对苦瓜素的抗病毒机制及其与干扰素 (INF)的关系进行探讨。方法　以CVB3 感染Balb/C小鼠建立病毒性心肌炎实验模型 ,随机分为苦瓜素处理组和生理盐水对照组 ,同时设立正常小鼠对照组。用定量逆转录聚合酶链反应技术(RT PCR)检测心肌组织中CVB3 RNA量 ,酶联免疫吸附试验 (ELISA)检测小鼠血浆INF α及INF γ含量。结果　苦瓜素处理组心肌中CVB3 RNA量明显低于生理盐水对照组 ,两者比较有显著差异 (t =5 .14 6 8　P =0 .0 0 0 9) ;生理盐水对照组INF α水平较正常小鼠对照组低 ,两者有显著差异 (P <0 .0 1) ,INF γ较正常稍高 ,但两者无显著差异 (P >0 .0 5 ) ;苦瓜素处理组两种INF水平均升高 ,与生理盐水对照组比较 ,INF α水平两者显著性差异 (P <0 .0 1) ,但INF γ水平两组无显著差异 (P >0 .0 5 ) ;心肌组织中CVB3 RNA量与血浆INF α具有明显负相关 (r=- 0 .8390　P =0 .0 0 2 4 ) ,而与INF γ相关性不明显 (r =- 0 .6 0 5 9　P =0 .0 6 34)。结论　苦瓜素抑制CVB3 RNA复制 ,为一种有效的抗CVB3 药物 ,抗病毒作用与诱生干扰素 ,尤其是与INF 展开更多

关键词 苦瓜素 心肌炎 病毒性 干扰素

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新的人突触相关蛋白(FRG4)抗原表位分析及抗体制备 被引量：2

4

作者 王仁 杨向东 +4 位作者 屈顺林 刘俊文 闾宏伟 姬志娟 盛树力 《中国免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2005年第7期531-534,共4页

目的:分析一个新的人突触相关蛋白(FRG4)抗原表位并制备其多克隆抗体。方法:从人胎肝文库PCR扩增获得FRG4基因全长cDNA序列;通过生物信息学分析,预测FRG4编码氨基酸序列的二级结构、抗原决定簇、功能结构域,并进行了多序列比对;采用固... 目的:分析一个新的人突触相关蛋白(FRG4)抗原表位并制备其多克隆抗体。方法:从人胎肝文库PCR扩增获得FRG4基因全长cDNA序列;通过生物信息学分析,预测FRG4编码氨基酸序列的二级结构、抗原决定簇、功能结构域,并进行了多序列比对;采用固相多肽合成法合成了FRG4抗原多肽,并免疫家兔;用免疫组化检测蛋白在人肝癌细胞HepG2细胞中的表达。结果:通过生物信息学分析选取抗原13肽PKLVKEEVFWRNY,制备兔抗人FRG4多克隆抗体。高效液相色谱检测显示抗体纯度达82.79%,抗体滴度为1∶16000,Westernblot证实该抗体具有较好的反应性和特异性,免疫组化证实其主要在HepG2细胞胞浆中表达。结论:成功制备了新的人突触相关蛋白(FRG4)多克隆抗体。 展开更多

关键词 巨噬细胞 动脉粥样硬化 突触相关蛋白 多肽合成 抗体

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MG132诱导人血管平滑肌细胞凋亡及对caspase3表达的影响 被引量：3

5

作者 郭芳 何慧 +2 位作者 孙文清 屈顺林 杨向东 《中国药物与临床》 CAS 2009年第5期381-383,450,共4页

目的观察蛋白酶体抑制剂MG132对人脐静脉血管平滑肌细胞(VSMC)的致凋亡作用及其对凋亡相关的天冬氨酸特异的半胱氨酸蛋白酶3(caspase3)表达的影响。方法采用多个浓度(2.5,5,10μmol/L)的蛋白酶体抑制剂MG132处理人脐静脉VSMC48h;DNA琼... 目的观察蛋白酶体抑制剂MG132对人脐静脉血管平滑肌细胞(VSMC)的致凋亡作用及其对凋亡相关的天冬氨酸特异的半胱氨酸蛋白酶3(caspase3)表达的影响。方法采用多个浓度(2.5,5,10μmol/L)的蛋白酶体抑制剂MG132处理人脐静脉VSMC48h;DNA琼脂糖凝胶电泳检测细胞凋亡;流式细胞术分析细胞周期和细胞凋亡率;反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测caspase3基因转录水平;免疫细胞化学检测细胞caspase3蛋白表达。结果蛋白酶体抑制剂MG132处理48h后细胞凋亡率增加;RT-PCR检测发现细胞内凋亡相关基因caspase3mRNA表达上调;免疫细胞化学检测细胞caspase3蛋白表达水平升高。结论蛋白酶体抑制剂MG132能够诱导人脐静脉VSMC凋亡,其作用呈量-效关系;MG132诱导VSMC凋亡的机制可能与MG132抑制泛素-蛋白酶体途径(UPP)活性,促进caspase3基因转录,使细胞内caspase3增加而促进细胞凋亡。 展开更多

关键词 肌 平滑 血管 细胞凋亡 泛素蛋白连接酶复合物 天冬氨酸特异的半胱氨酸蛋白酶3

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人NKG2D真核表达载体的构建及其在COS-7细胞中的瞬时表达 被引量：3

6

作者 刘映霞 胡国龄 +3 位作者 刘敏 谭德明 沙新平 何淑雅 《湖南医科大学学报》 CSCD 北大核心 2003年第6期579-582,共4页

目的 :构建人NKG2D重组真核表达载体 ,并研究其在COS 7细胞中的表达。方法 :应用RT PCR ,自健康人外周血单个核细胞 (PBMC)中获取NKG2DcDNA ,应用基因重组技术构建含目的基因的T载体克隆后 ,构建含目的基因的真核细胞表达质粒 ,并经酶... 目的 :构建人NKG2D重组真核表达载体 ,并研究其在COS 7细胞中的表达。方法 :应用RT PCR ,自健康人外周血单个核细胞 (PBMC)中获取NKG2DcDNA ,应用基因重组技术构建含目的基因的T载体克隆后 ,构建含目的基因的真核细胞表达质粒 ,并经酶切和测序证实。然后应用脂质体介导将重组真核表达质粒转染COS 7细胞 ,用RT PCR和流式细胞术 (FCM)检测转染细胞NKG2D表达。结果 :重组真核表达载体中插入片段序列与GeneBank登录的cDNA序列一致。NKG2D在COS 7细胞中获得表达。结论 :成功地构建了重组表达载体pcD NA3.1 NKG2D ,并实现了在COS 7细胞中的瞬时表达 ,为研究NKG2D的生物学活性奠定了基础。 展开更多

关键词 基因克隆 COS-7细胞 基因表达

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MG132诱导HepG_2细胞凋亡及其对p53表达的影响 被引量：1

7

作者 何慧 郭芳 +4 位作者 屈顺林 任重 刘俊文 杨向东 汤劲松 《中国药物与临床》 CAS 2005年第1期21-23,共3页

目的观察蛋白酶体抑制剂MG132对人肝癌细胞系HepG2的致凋亡作用及其对凋亡相关基因p53蛋白表达的影响。方法采用多个浓度(2,5,10μmol/L)的蛋白酶体抑制剂MG132处理HepG2细胞;流式细胞术和Hoechst荧光染色检测细胞凋亡;免疫细胞化学检测... 目的观察蛋白酶体抑制剂MG132对人肝癌细胞系HepG2的致凋亡作用及其对凋亡相关基因p53蛋白表达的影响。方法采用多个浓度(2,5,10μmol/L)的蛋白酶体抑制剂MG132处理HepG2细胞;流式细胞术和Hoechst荧光染色检测细胞凋亡;免疫细胞化学检测HepG2细胞p53蛋白含量。结果对照组HepG2细胞凋亡率低于5%,在2,5,10μmol/LMG132作用下,细胞凋亡率分别为42.9%,66.1%和72.8%,MG132诱导HepG2细胞凋亡具有剂量—效应关系。经Hoechst荧光染色可见细胞染色质浓缩等凋亡改变。免疫组织化学检测HepG2细胞p53蛋白表达水平增高。结论蛋白酶体抑制剂MG132能够诱导HepG2细胞凋亡,其作用呈剂量—效应关系;p53蛋白表达增加与MG132抑制泛素—蛋白酶体系统降解细胞内p53蛋白有关。 展开更多

关键词 HepG2细胞凋亡 P53表达 人肝癌细胞系HEPG2 蛋白酶体抑制剂 p53蛋白表达 Hoechst 剂量-效应关系 泛素-蛋白酶体系统 免疫组织化学检测 细胞凋亡率 凋亡相关基因 荧光染色检测 蛋白表达水平 流式细胞术 mol/L 细胞染色质

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泛素-蛋白酶体途径介导的细胞周期调节蛋白的水解 被引量：4

8

作者 刘俊文 杨向东 《国外医学（老年医学分册）》 2005年第1期30-34,共5页

泛素-蛋白酶体途径高选择性地降解细胞在应激和非应激条件下产生的异常蛋白质,对维持细胞正常生理功能具有十分重要的意义。在蛋白质降解过程中泛素的重要作用越来越得到研究者的重视。许多研究表明泛素-蛋白酶体途径介导的蛋白水解在... 泛素-蛋白酶体途径高选择性地降解细胞在应激和非应激条件下产生的异常蛋白质,对维持细胞正常生理功能具有十分重要的意义。在蛋白质降解过程中泛素的重要作用越来越得到研究者的重视。许多研究表明泛素-蛋白酶体途径介导的蛋白水解在真核细胞 G_1→S期过程中起着至关重要的作用。本文就细胞周期 G_1、S 期中由泛素介导的几种重要的细胞周期调节蛋白的水解作一综述。 展开更多

关键词 细胞周期调节蛋白 泛素-蛋白酶体途径 介导 正常 真核细胞 应激条件 生理功能 蛋白质降解 蛋白水解 维持

原文传递

蛋白酶体抑制剂MG132诱导人血管平滑肌细胞凋亡及其机制研究

9

作者 郭芳 屈顺林 +2 位作者 孙文清 何慧 杨向东 《中国临床药理学与治疗学》 CAS CSCD 2009年第5期487-492,共6页

目的:观察蛋白酶体抑制剂MG132对人脐静脉血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMC)的致凋亡作用及其对凋亡相关的天冬氨酸特异的半胱氨酸蛋白酶3(caspase 3)表达的影响。方法:采用多个浓度(2.5、5、10μmol/L)的蛋白酶体抑制... 目的:观察蛋白酶体抑制剂MG132对人脐静脉血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMC)的致凋亡作用及其对凋亡相关的天冬氨酸特异的半胱氨酸蛋白酶3(caspase 3)表达的影响。方法:采用多个浓度(2.5、5、10μmol/L)的蛋白酶体抑制剂MG132处理人脐静脉VSMC 24 h和48 h;流式细胞术分析细胞凋亡率;RT-PCR检测泛素-蛋白酶体途径(ubiquitin-proteasome pathway,UPP)相关基因泛素、泛素活化酶(E1)、泛素缀合酶(E2)、泛素连接酶(E3)、26S蛋白酶体和caspase3基因转录水平;免疫细胞化学检测细胞caspase 3蛋白表达。结果:蛋白酶体抑制剂MG132处理48 h后细胞凋亡率增加;细胞内UPP相关的基因mRNA表达降低,而caspase 3 mRNA表达增高;免疫细胞化学检测细胞caspase 3蛋白表达水平升高。结论:蛋白酶体抑制剂MG132能够诱导人脐静脉VSMC凋亡,其作用呈量-效关系;MG132诱导VSMC凋亡与下调UPP相关基因和上调caspase3基因及蛋白的表达有关。 展开更多

关键词 人脐静脉血管平滑肌细胞 泛素-蛋白酶体通路 抑制剂 凋亡 天冬氨酸特异的半胱氨酸蛋白酶3

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人CMV/ARL-1真核表达载体的构建(英文)

10

作者 郑春华 曹德良 +5 位作者 万腊香 杨永宗 周胜华 祁述善 刘启明 李旭平 《中国现代医学杂志》 CAS CSCD 2004年第8期31-33,38,共4页

关键词 醛糖还原酶相似基因 表达载体 构建

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蛋白酶体抑制剂对肝癌细胞多药耐药基因表达的影响

11

作者 何慧 苏波 +2 位作者 杨向东 郭芳 孙文清 《中国药物与临床》 CAS 2007年第7期527-528,共2页

目的观察蛋白酶体抑制剂MG132对表阿霉素(EPI)诱导肝癌细胞系HepG2细胞多药耐药(MDR)基因表达的影响。方法采用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测多药耐药(MDR)基因mRNA的表达。结果经1μg/mlEPI处理12h后,HepG2细胞MDR基因mRNA转录水平... 目的观察蛋白酶体抑制剂MG132对表阿霉素(EPI)诱导肝癌细胞系HepG2细胞多药耐药(MDR)基因表达的影响。方法采用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测多药耐药(MDR)基因mRNA的表达。结果经1μg/mlEPI处理12h后,HepG2细胞MDR基因mRNA转录水平增高。联合应用1μg/mlEPI和1μmol/LMG132,HepG2细胞MDR基因mRNA表达较单用EPI时降低。结论MG132能够下调表阿霉素处理后HepG2细胞MDR基因mRNA转录水平。 展开更多

关键词 蛋白酶抑制药 肝肿瘤 基因表达

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高表达醛糖还原酶相似基因细胞株的建立和鉴定

12

作者 王建 万腊香 等 《美国中华临床医学杂志》 2002年第2期90-92,共3页

目的 建立高表达醛糖还原酶相似基因的细胞株。方法 通过阳离子脂质体转染法将醛糖还原酶相似基因导入HepG2细胞，建立稳定表达该基因的细胞株，采用PCR，RT-PCR等方法鉴定醛糖还原酶相似基因在HepG2中的表达情况。结果 成功建立了高表... 目的 建立高表达醛糖还原酶相似基因的细胞株。方法 通过阳离子脂质体转染法将醛糖还原酶相似基因导入HepG2细胞，建立稳定表达该基因的细胞株，采用PCR，RT-PCR等方法鉴定醛糖还原酶相似基因在HepG2中的表达情况。结果 成功建立了高表达醛糖还原酶相似的转染细胞株。 展开更多

关键词 醛糖还原酶相似蛋白 细胞转染 肝癌 PCR RT-PCR方法

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醛糖还原酶相似基因转染细胞对含碳酰基抗癌药物耐药的研究

13

作者 王建 万腊香 +3 位作者 吴孟津 万载阳 危当恒 杨永宗 《中华肝脏病杂志》 CAS CSCD 2002年第6期445-448,共4页

目的 研究醛糖还原酶相似蛋白(aldose reductase like prptein,ARL-1)在肝癌细胞中的功能及ARL-1基因高表达与肝癌耐药之间的关系。方法 通过阳离子脂质体转染法将ARL-1基因导入HepG2细胞,建立稳定表达该基因的细胞株,采用MTT法检测细... 目的 研究醛糖还原酶相似蛋白(aldose reductase like prptein,ARL-1)在肝癌细胞中的功能及ARL-1基因高表达与肝癌耐药之间的关系。方法 通过阳离子脂质体转染法将ARL-1基因导入HepG2细胞,建立稳定表达该基因的细胞株,采用MTT法检测细胞对含醛基药物的耐药变化情况。结果 转染细胞与未转染细胞相比,对含醛基的抗肿瘤药物如阿霉素、丝裂霉素的耐药性明显增强,其半数抑制浓度(IC50)分别提高到2.6倍和3.1倍,ADM组t=6.39,P<0.05,MMC组t=30.06,P<0.01。用不含醛基的5-氟尿嘧啶处理两组细胞,则未发现有明显的耐药差异(t=0.684,P>0.05)。结论 ARL-1的表达上调可能是肿瘤细胞对含醛基抗肿瘤药物耐药的主要原因之一。 展开更多

关键词 碳酰基 醛糖还原酶相似蛋白 耐药 肝癌 细胞转染

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新的人突触相关蛋白(FRG4)多重序列及进化分析

14

作者 王仁 杨向东 +2 位作者 冯大明 孙文清 郭芳 《云南大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 2004年第S2期28-32,共5页

运用热启动PCR末端延伸快速分离FRG4基因全长cDNA序列,经克隆测序后进行多重序列分析,FRG4与人突触相关蛋白(HomosapiensSynapse-associatedProtein,SAP1)有着高度的同源性(核酸同源性为99%,氨基酸同源性为87%),选取拥有BSD功能域的序... 运用热启动PCR末端延伸快速分离FRG4基因全长cDNA序列,经克隆测序后进行多重序列分析,FRG4与人突触相关蛋白(HomosapiensSynapse-associatedProtein,SAP1)有着高度的同源性(核酸同源性为99%,氨基酸同源性为87%),选取拥有BSD功能域的序列进行对齐分析。发现特别是130～220位氨基酸之间具有高度的同源性。说明在这一区域可能含有一重要的功能域,而预测到的BSD正好位于这一区域.进化分析。FRG4编码蛋白形成突触相关蛋白家族(SAP家族)一个独立的分支,FRG4的BSD功能域与SAP家族的PDZ,SH3,GK功能域比较。其同源性低于10%,说明在长期的进化过程中,FRG4编码蛋白已逐渐发生变异.可能是SAP家族中一种新的蛋白. 展开更多

关键词 FRG4蛋白 序列分析 分子进化 进化树

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