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hPP10-Cu,Zn-SOD融合蛋白的制备、穿膜效应及其抗氧化、抗炎症功效
1
作者 张洁 姚君妍 +4 位作者 杨英桂 王飞 郑清友 李欣 柳长柏 《南方医科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第6期1059-1069,共11页
目的 探究人源性细胞膜穿透肽hPP10携带人源性抗氧化蛋白Cu,Zn-SOD的穿膜效应并观察其抗氧化、抗炎功效。方法利用RT-PCR技术扩增人源性SOD基因片段、酶切连接法构建重组质粒pET15b-Cu,Zn-SOD,pET15b-hPP10-Cu,Zn-SOD;利用镍柱亲和层析... 目的 探究人源性细胞膜穿透肽hPP10携带人源性抗氧化蛋白Cu,Zn-SOD的穿膜效应并观察其抗氧化、抗炎功效。方法利用RT-PCR技术扩增人源性SOD基因片段、酶切连接法构建重组质粒pET15b-Cu,Zn-SOD,pET15b-hPP10-Cu,Zn-SOD;利用镍柱亲和层析法、分子筛方法纯化Cu,Zn-SOD、hPP10-Cu,Zn-SOD融合蛋白并利用Western blotting法鉴定其正确性;利用免疫荧光法、荧光共定位实验、Western blotting法鉴定hPP10-Cu,Zn-SOD在细胞中的穿膜效应;利用Western blotting法鉴定hPP10-Cu,Zn-SOD融合蛋白穿膜时间梯度和浓度梯度效应;利用SOD酶活性测定试剂盒检测hPP10-Cu,Zn-SOD穿膜后的SOD酶活性;利用MTT法检测hPP10对细胞活性的影响。利用H2O2建立HEK293氧化应激细胞模型,通过流式细胞分析术(FCM)分析hPP10-Cu,Zn-SOD穿膜后细胞凋亡情况;并RT-qPCR分析hPP10-Cu,Zn-SOD穿膜后凋亡相关因子的表达情况;通过ROS检测分析hPP10-Cu,Zn-SOD穿膜后抗氧化能力。TPA诱导建立小鼠耳部炎症模型(5只/组,共4组),然后RT-qPCR分析hPP10-Cu,Zn-SOD穿膜后,NFκB,IL-1β、IL-6、TNFα因子的转录情况;Western blotting检测NFκB p65、p-NFκB p65、IL-1β、TNFα基因的表达;免疫组化分析炎性因子p-NFκB p65、TNFα基因的表达。结果 成功构建了重组质粒pET15b-Cu,Zn-SOD,pET15b-hPP10-Cu,Zn-SOD,并获得Cu,Zn-SOD蛋白和hPP10-Cu,Zn-SOD融合蛋白;免疫荧光试验结果表明5μmol/L浓度的hPP10-Cu,Zn-SOD转导HEK293细胞具有明显的穿膜效应;荧光共定位实验显示融合蛋白hPP10-Cu,Zn-SOD入胞后定位在细胞膜内,部分蛋白定位在细胞核内;Western blotting实验结果表明hPP10-Cu,Zn-SOD转导Hela(P<0.05),HEK293(P<0.01)细胞具有浓度依赖性,细胞内hPP10-Cu,Zn-SOD存在可持续24 h;5μmol/L的hPP10-Cu,Zn-SOD转导细胞具有较好的抗氧化活性(P<0.01);MTT结果显示高达10μmol/L浓度的hPP10-Cu,Zn-SOD对于细胞活力的影响小。在氧化应激模型中,FCM结果显示hPP10-Cu,Zn-SOD融合蛋白孵育细胞降低了细胞的早期凋亡(P<0.01)和晚期凋亡(P<0.05);RT-qPCR结果显示hPP10-Cu,Zn-SOD融合蛋白孵育细胞使Bcl2、Mcl1、Deptor等抗凋亡因子升高(P<0.05),降低了Bad、P21、P27等促凋亡因子的表达(P<0.05);ROS结果显示hPP10-Cu,Zn-SOD融合蛋白孵育细胞显著降低了细胞内的活性氧含量(P<0.01)。在炎症模型中,hPP10-Cu,Zn-SOD融合蛋白可显著降低IL-1β、IL-6、TNFα因子的转录(P<0.05);p-NFκB p65、IL-1β及TNFα的表达都呈现了抑制作用(P<0.05);hPP10-Cu,Zn-SOD融合蛋白处理组较Cu,Zn-SOD蛋白处理组,降低了炎性因子p-NFκB p65及TNFα基因的表达(P<0.05)。结论 融合蛋白hPP10-Cu,Zn-SOD具有明显的穿膜入胞、抗氧化、抗炎功效,且对细胞毒副作用很小。这些结果为hPP10作为新的递送载体奠定基础,也为hPP10-Cu,Zn-SOD应用于护肤品等提供了理论依据。 展开更多
关键词 人源性细胞膜穿透肽hPP10 铜锌超氧化物歧化酶Cu Zn-SOD 抗氧化 抗炎 酶活力测定
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RNA结合蛋白Musashi2在实体瘤中的研究进展 被引量：2
2
作者 杨英桂 赵敏 +3 位作者 丁腾腾 倪楚萍 郑清友 李欣 《南方医科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2022年第3期448-456,共9页
RNA结合蛋白(RBP)在基因调控过程中扮演着关键的作用,参与RNA的翻译、修饰、剪接和转运等重要生命活动,探索RBP对RNA的具体作用意义重大。多项研究表明RBP的异常表达与多种疾病相关。哺乳动物的Musashi(Msi)家族是一类进化保守且功能强... RNA结合蛋白(RBP)在基因调控过程中扮演着关键的作用,参与RNA的翻译、修饰、剪接和转运等重要生命活动,探索RBP对RNA的具体作用意义重大。多项研究表明RBP的异常表达与多种疾病相关。哺乳动物的Musashi(Msi)家族是一类进化保守且功能强大的RBP,其家族成员Msi1和Msi2在调控干细胞活性和肿瘤发生发展中具有重要的作用,具体为通过绑定并调节mRNA的翻译、稳定性及其下游的细胞信号通路从而调控机体的多种生物学进程,其中Msi2与胚胎的生长发育、肿瘤干细胞的维持、血液系统肿瘤的发展等密切相关,而近年来越来越多的报道证实Msi2在实体性肿瘤发生发展中同样发挥着至关重要的作用,主要影响肿瘤的增殖、侵袭、转移及耐药等。具体机制上Msi2主要涉及Wnt/β-catenin、TGF-β/SMAD3、Akt/mTOR、JAK/STAT和Numb及其相关信号通路(Notch、p53和Hedgehog通路)等信号通路。将Msi2基因作为靶点指导肿瘤治疗的临床前研究目前取得了一些初步的成果。本文就Msi2的分子结构、生理功能、在多种实体瘤的发生发展中的作用以及相关信号通路等方面的最新研究进展进行综述。 展开更多
关键词 RNA结合蛋白 Musashi2 实体瘤 小分子抑制剂
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乳腺癌患者体内多环芳烃暴露水平及其代谢酶基因甲基化的研究
3
作者 夏力旦·阿力甫 鲁英 王飞 《新疆医科大学学报》 CAS 2020年第10期1312-1317,共6页
目的探讨乳腺癌患者外周血谷胱甘肽-S-转移酶P1(GSTPl)基因启动子区甲基化的意义,了解患者生活、饮食习惯、病理分型与多环芳烃负荷水平及GSTP1基因甲基化水平的关系。方法通过1∶1同民族、年龄相差±2岁配对的病例对照研究,选择入... 目的探讨乳腺癌患者外周血谷胱甘肽-S-转移酶P1(GSTPl)基因启动子区甲基化的意义,了解患者生活、饮食习惯、病理分型与多环芳烃负荷水平及GSTP1基因甲基化水平的关系。方法通过1∶1同民族、年龄相差±2岁配对的病例对照研究,选择入住于新疆某三甲医院的新疆常住各族女性原发性乳腺癌患者39例为病例组,无乳腺癌及肿瘤史的体检健康女性39例为对照组。收集患者晨尿和静脉血,采用液质联用法检测尿液中的多环芳烃代谢物的含量,焦磷酸测序法检测外周血中GSTP1基因启动子区甲基化。所获计数资料用χ^2检验或Fisher确切概率法进行统计分析,非正态计量资料进行配对秩和检验。结果病例组食用腌制、烧烤类食物人数占比较高(P<0.05);病例组初潮年龄较对照组更偏向年轻化(P<0.05)。尿中多环芳烃代谢产物检测结果显示,病例组尿中的1-羟基芘、9-羟基菲、2-羟基萘及1-羟基萘水平高于对照组(P<0.05)。尿中的2-羟基芴在乳腺癌患者的人表皮生长因子受体2(Her-2)阴性组与阳性组之间差异有统计学意义(P<0.05)。三阴乳腺癌与非三阴乳腺癌患者尿中9-羟基菲、2-羟基芴的浓度差异有统计学意义(P<0.05)。孕激素受体(PR)阴性组与阳性组的GSTP1 PM00151816 CPG-1甲基化程度差异有统计学意义,Her-2阴性与阳性组的GSTP1 PM00151816 CPG-3、CPG-4甲基化程度差异有统计学意义。结论体内多环芳烃的负荷可能与乳腺癌的发生有关,GSTPl基因CPG的甲基化可为不同分子分型乳腺癌的治疗与预后提供补充和参考。 展开更多
关键词 病例对照研究 乳腺癌 多环芳烃 GSTP1基因 DNA甲基化
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