蝮蛇毒小分子多肽的分离、纯化及其抗肿瘤作用研究 被引量：26

1

作者 张及禄 文慧民 孙德军 《中国生化药物杂志》 CAS CSCD 北大核心 2009年第4期217-220,225,共5页

目的从长白山岩栖蝮蛇蛇毒中分离纯化1种小分子多肽Saxis,测定理化性质,研究其对肿瘤细胞的生长抑制作用。方法利用有机溶剂沉淀和Sephadex G-50S、ephadex G-25凝胶过滤色谱等方法分离纯化长白山栖岩蝮蛇蛇毒中的1种小分子多肽Saxis;采... 目的从长白山岩栖蝮蛇蛇毒中分离纯化1种小分子多肽Saxis,测定理化性质,研究其对肿瘤细胞的生长抑制作用。方法利用有机溶剂沉淀和Sephadex G-50S、ephadex G-25凝胶过滤色谱等方法分离纯化长白山栖岩蝮蛇蛇毒中的1种小分子多肽Saxis;采用Tricine-SDS-PAGE鉴定;利用Bradford蛋白质测定法测定蛋白质浓度;运用MTT比色法检测该小分子多肽对宫颈癌细胞Hela、肝癌细胞SMMC-7721和胃腺癌细胞SGC-7901的生长抑制作用。结果该小分子多肽Saxis的相对分子质量约为5 200,它能抑制Hela、SMMC-7721和SGC-7901细胞的增殖,并且对这3种肿瘤细胞的抗增殖作用具有药物剂量依赖关系,24 h的IC50分别为66.3,54.5,62.2μg/mL。结论利用有机溶剂沉淀和凝胶过滤色谱法可以从长白山岩栖蝮蛇蛇毒中分离纯化1种小分子多肽Saxis,其对多种肿瘤细胞的生长有抑制作用。 展开更多

关键词 蛇毒 多肽 分离纯化 肿瘤细胞

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具有自激活切割活性肠激酶轻链基因设计、表达及活性研究 被引量：2

2

作者 朱文赫 郭志刚 +2 位作者 刘红建 郭祥瑞 孙德军 《中国生化药物杂志》 CAS CSCD 北大核心 2011年第1期6-10,共5页

目的获得Asp-Asp-Asp-Asp-Lys序列+牛EKL的cDNA序列,实现EKL基因在大肠杆菌中的融合表达和自切割。方法用Trizol法从牛十二指肠组织中提取总RNA,利用RT-PCR技术扩增其cDNA片段,将此片段克隆于表达载体pGEX-2T,并在其前引入肠激酶(EK)识... 目的获得Asp-Asp-Asp-Asp-Lys序列+牛EKL的cDNA序列,实现EKL基因在大肠杆菌中的融合表达和自切割。方法用Trizol法从牛十二指肠组织中提取总RNA,利用RT-PCR技术扩增其cDNA片段,将此片段克隆于表达载体pGEX-2T,并在其前引入肠激酶(EK)识别序列。结果所表达蛋白经SDS-PAGE分析,相对分子质量约为61 000,经GST-Sepharose亲和色谱柱纯化后得到单一蛋白,SDS-PAGE显示单一条带,用微量EK引发自切割,切断GST标签蛋白和Asp-Asp-Asp-Asp-Lys序列,采用对氨基苯甲脒-Sepharose亲和色谱获得了轻链EK的单体。结论成功地克隆、表达了牛EK轻链基因,采用自激活、切割获得了EK单体,每1 L培养基获得EK5 mg,为进一步进行重组牛EK活性的研究及应用奠定了基础。 展开更多

关键词 肠激酶 大肠杆菌表达系统 谷胱甘肽转移酶 自激活

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华蟾素诱导HL-60细胞凋亡及机制研究 被引量：1

3

作者 霍英 徐华丽 孙德军 《中国药师》 CAS 2008年第10期1158-1160,共3页

目的:观察华蟾素(cinobufacini)对白血病HL-60细胞的增殖抑制作用和诱导凋亡作用的机制。方法:以HL-60细胞为研究对象,采用MTT法观察细胞增殖作用;Annexin V-FITC/PI双染和吖啶橙/溴乙锭(AO/EB)荧光染色法检测细胞凋亡;罗丹明染色法检... 目的:观察华蟾素(cinobufacini)对白血病HL-60细胞的增殖抑制作用和诱导凋亡作用的机制。方法:以HL-60细胞为研究对象,采用MTT法观察细胞增殖作用;Annexin V-FITC/PI双染和吖啶橙/溴乙锭(AO/EB)荧光染色法检测细胞凋亡;罗丹明染色法检测线粒体膜电位;分光光度法检测Caspase-3活性。结果:在0.78～6.25μg·m^(-1),华蟾素能明显的抑制HL-60细胞的增殖;华蟾素作用24h后,Annexin V阳性的细胞从7.81%增加至66.02%,而且在荧光显微镜下可以明显观察到凋亡细胞;线粒体膜电位下降和Caspase-3活性升高。结论:华蟾素能够抑制HL-60细胞增殖,这种作用与其诱导细胞凋亡破坏线粒体功能和激活Caspase-3有关。 展开更多

关键词 华蟾素 HL-60 细胞凋亡 CASPASE-3

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嗜酸乳杆菌高密度培养工艺条件的优化及其评价 被引量：6

4

作者 宋艳 李岳飞 +2 位作者 王智鼎 宋帅 孙德军 《吉林大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2013年第5期1036-1040,共5页

目的:探讨嗜酸乳杆菌培养条件,研制出一种菌活性高、密度大、操作简便、易于生产应用的发酵工艺,阐明乳酸菌直投式发酵剂的生产和应用。方法:选取嗜酸乳杆菌中国株为菌种,根据培养基成分的配比不同,分为实验组和对照组,优化培养条件以及... 目的:探讨嗜酸乳杆菌培养条件,研制出一种菌活性高、密度大、操作简便、易于生产应用的发酵工艺,阐明乳酸菌直投式发酵剂的生产和应用。方法:选取嗜酸乳杆菌中国株为菌种,根据培养基成分的配比不同,分为实验组和对照组,优化培养条件以及MRS液体培养基的配方,通过紫外分光光度计检测菌液的吸光度(A650)值和活菌数量变化,筛选出最优的工艺过程。结果:通过筛选确定嗜酸乳杆菌的最佳培养条件是接种量1%,初始pH值6.2,37℃恒温厌氧培养23h;最适培养基配方为3.5%蛋白胨、0.5%酵母提取物、2%葡萄糖、0.2%柠檬酸铵、0.088%磷酸氢二钠、0.6%乙酸钠、0.025%硫酸锰、0.06%硫酸镁、1%营养因子和0.1%吐温80;由最适培养工艺培养得到的菌种数可达1.43×1011 cfu·mL-1,较传统培养方案相比菌种数增长约1×1011 cfu·mL-1,且工艺简便易行。结论:实现对嗜酸乳杆菌培养条件和培养基配方的优化,得到嗜酸乳杆菌最优培养工艺条件,菌种的高密度培养可用于乳酸菌直投式发酵剂的制备和应用。 展开更多

关键词 嗜酸乳杆菌 高密度 培养条件 优化 工艺

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蜂毒肽基因在大肠杆菌中的表达、纯化及初步鉴定 被引量：8

5

作者 朱文赫 田立玲 +1 位作者 孙妙囡 孙德军 《中国生化药物杂志》 CAS CSCD 北大核心 2010年第1期1-5,共5页

目的通过pGEX-2T原核表达载体表达蜂毒肽。方法将人工合成整合了肠激酶作用位点的蜂毒肽基因,插入载体pGEX-2T,构建蜂毒肽与谷胱甘肽S-转移酶(GST)融合表达载体pGEX-MEL。重组质粒转化E.coliBL21(DE3)诱导表达,超声破碎菌体,SDS-PAGE检... 目的通过pGEX-2T原核表达载体表达蜂毒肽。方法将人工合成整合了肠激酶作用位点的蜂毒肽基因,插入载体pGEX-2T,构建蜂毒肽与谷胱甘肽S-转移酶(GST)融合表达载体pGEX-MEL。重组质粒转化E.coliBL21(DE3)诱导表达,超声破碎菌体,SDS-PAGE检测蛋白表达情况,取超声上清,通过GST亲和色谱系统纯化目的融合蛋白,酶切通过溶血实验检测其溶血活性。结果SDS-PAGE结果显示,表达了相对分子质量约为30 000的融合蛋白,目的融合蛋白量约占菌体总蛋白量的29.5%。经Western blot鉴定,表达的GST融合蛋白与GST抗体有强烈的交叉反应,说明成功表达了目的融合蛋白。取超声上清,亲和色谱纯化融合蛋白,纯度为95%。肠激酶切割得到了人工天然蜂毒肽,测定蜂毒肽回收率为80%。结论通过原核表达系统成功表达蜂毒肽,具有和天然蜂毒相同的溶血活性。 展开更多

关键词 蜂毒肽 大肠杆菌 表达 纯化

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核糖核酸Ⅱ制备及其病毒灭活工艺的验证 被引量：8

6

作者 朱文赫 孙妙囡 孙德军 《中国生化药物杂志》 CAS CSCD 2008年第5期332-334,共3页

目的从牛胰脏制备核糖核酸Ⅱ(RNAⅡ),对巴氏灭活法灭活病毒工艺进行验证。方法以苯酚、氯仿抽提法制备,以猪细小病毒(PPV)为指示病毒,观察用巴氏灭活法(60℃,10h)灭活RNAⅡ原液中病毒的效果,用纯度、A260/A280比值、紫外特征峰、完整性... 目的从牛胰脏制备核糖核酸Ⅱ(RNAⅡ),对巴氏灭活法灭活病毒工艺进行验证。方法以苯酚、氯仿抽提法制备,以猪细小病毒(PPV)为指示病毒,观察用巴氏灭活法(60℃,10h)灭活RNAⅡ原液中病毒的效果,用纯度、A260/A280比值、紫外特征峰、完整性、含量变化考察灭活前后制剂变化。结果制备了纯度和活性均较好的RNAⅡ,PPV滴度为7.7logTCID50/0.1mL时灭活液中未检测出PPV,经盲传3代,亦未发现特异性细胞病变,灭活前后制剂无质的变化。结论可以现行方法从牛胰脏制备较高纯度RNAⅡ,巴氏法能对RNAⅡ溶液作有效的病毒灭活处理。 展开更多

关键词 核糖核酸Ⅱ 制备 病毒灭活 巴氏法

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兔心肌中次黄嘌呤纯化工艺的优化 被引量：4

7

作者 宋艳 王智鼎 +3 位作者 李岳飞 邱岚 姜秀梅 孙德军 《中国生化药物杂志》 CAS CSCD 北大核心 2012年第6期839-841,共3页

目的探索从兔心肌中提取次黄嘌呤的最佳工艺。方法比较三氟乙酸法、酶解法、酸碱法和醇沉法提取的次黄嘌呤的产率和纯度,得到优化制备工艺。结果利用醇沉法,向细胞充分破碎后的匀浆液中加入4倍体积的纯水,超声提取,向提取液中加入乙醇... 目的探索从兔心肌中提取次黄嘌呤的最佳工艺。方法比较三氟乙酸法、酶解法、酸碱法和醇沉法提取的次黄嘌呤的产率和纯度,得到优化制备工艺。结果利用醇沉法,向细胞充分破碎后的匀浆液中加入4倍体积的纯水,超声提取,向提取液中加入乙醇至浓度60%,置60℃水浴反应120 min,提取的次黄嘌呤产率为0.83 mg/g,纯度为82.4%。结论经过纯化工艺比较,醇沉法提取的次黄嘌呤的含量和纯度优于其他方法。 展开更多

关键词 次黄嘌呤 纯化 工艺 优化

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乌苏里蝮蛇毒一种C-型凝集素相关蛋白的分离、纯化及活性测定 被引量：3

8

作者 刘立 田刚 +1 位作者 宋艳 孙德军 《中国生化药物杂志》 CAS CSCD 北大核心 2012年第6期805-808,共4页

目的从乌苏里蝮蛇蛇毒中分离纯化得到具有促凝血活性的C-型凝集素相关蛋白。方法利用IDA-Sepharose FF亲和色谱作为独立的蛋白分离纯化手段,并且结合Sephadex G-100,Sephadex G-50凝胶过滤色谱从乌苏里蝮蛇蛇毒中分离得到一个新的蛋白... 目的从乌苏里蝮蛇蛇毒中分离纯化得到具有促凝血活性的C-型凝集素相关蛋白。方法利用IDA-Sepharose FF亲和色谱作为独立的蛋白分离纯化手段,并且结合Sephadex G-100,Sephadex G-50凝胶过滤色谱从乌苏里蝮蛇蛇毒中分离得到一个新的蛋白组分。结果该组分经还原和非还原SDS-PAGE电泳鉴定结果显示为均一的单一条带,即C-型凝集素相关蛋白,相对分子质量约为15.7 kD。结论经过一系列的分离和纯化,能够从乌苏里蝮蛇蛇毒中提取到C-型凝集素相关蛋白组分。 展开更多

关键词 乌苏里蝮蛇蛇毒 C-型凝集素相关蛋白(CLRPs) 分离纯化 活性测定

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肌氨肽苷制备工艺及其病毒去除方法的验证 被引量：4

9

作者 孙妙囡 孙德军 王智鼎 《中国生化药物杂志》 CAS CSCD 2008年第6期395-397,共3页

目的研究肌氨肽苷制备工艺并对超滤法去除病毒工艺进行验证。方法以家兔心脏和肌肉为原料,制得肌氨肽苷原液。并以猪细小病毒(PPV)为指示病毒,观察用截留相对分子质量为10 000的超滤器在进压0.12MPa、回流压0.05 MPa和进压0.20 MPa、回... 目的研究肌氨肽苷制备工艺并对超滤法去除病毒工艺进行验证。方法以家兔心脏和肌肉为原料,制得肌氨肽苷原液。并以猪细小病毒(PPV)为指示病毒,观察用截留相对分子质量为10 000的超滤器在进压0.12MPa、回流压0.05 MPa和进压0.20 MPa、回流压0.12 MPa条件下去除肌氨肽苷原液中病毒的效果,并以牛血清白蛋白为对照品,20%磺基水杨酸作为指示剂的条件下,对超滤膜的完整性进行验证。结果滤过液中未检测出PPV,经过盲传3代,也未发现特异性细胞病变;磺基水杨酸检测未变浑浊,表明膜完整性好,超滤设备可用。结论制备肌氨肽苷的方法可行,且所采用的超滤法去除PPV是1种有效去除病毒的方法。 展开更多

关键词 肌氨肽苷 生产工艺 超滤法 病毒去除法

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一种迅捷、经济及高效回收DNA片段方法的建立 被引量：1

10

作者 杨春伟 孙妙囡 孙德军 《吉林大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2008年第5期910-913,共4页

目的:建立一种迅捷、经济、高效的从凝胶中回收DNA的方法。方法:以二氯二甲基硅烷硅化晴纶纱,以硅化的晴纶纱作为过滤垫层,冻融处理凝胶,离心收集液体,计算不同硅化晴纶纱厚度、不同冻融时间、不同离心力、不同离心时间和不同DNA片段长... 目的:建立一种迅捷、经济、高效的从凝胶中回收DNA的方法。方法:以二氯二甲基硅烷硅化晴纶纱,以硅化的晴纶纱作为过滤垫层,冻融处理凝胶,离心收集液体,计算不同硅化晴纶纱厚度、不同冻融时间、不同离心力、不同离心时间和不同DNA片段长度的DNA回收率。结果:用硅化晴纶纱从凝胶中回收DNA时,0.5～2.0mm硅化晴纶纱厚度DNA片段回收率均在85%左右,提示不同硅化晴纶纱厚度对DNA片段回收率影响较小;冻融时间在30min前,随着冻融时间延长,回收率上升明显,至30min回收率达85%,再增加冻融时间回收率变化不显著,提示冻融时间对回收率影响较大,冻融时间应为1h;在5000r.min-1前,随着离心力增加,回收率上升明显,至5000r.min-1回收率达85%,再增加转速,回收率有略微上升,提示离心力对回收率影响较大,离心力应超过10000r.min-1(约合10000g);以10000r.min-1离心,30min前,离心时间对回收率影响较大,至30min时,回收率达85%,增加离心时间,回收率不再增加;250～2000bp长度DNA片段,回收率为80.7%～88.4%,即使100bp小片段回收率也能达到76%以上,表明片段大小对回收率影响较小,说明本方法的有效性。结论:硅化晴纶纱厚度0.5～2.0mm,冻融时间≥1h,离心力≥10000g,离心时间30minDNA回收率较高;硅化晴纶纱法可以高效地从电泳凝胶中回收目的DNA片段。 展开更多

关键词 DNA 回收 硅化晴纶纱

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补体过度活化对急性移植物抗宿主病病理过程的影响

11

作者 张及禄 侯春梅 +6 位作者 魏应林 李新颖 孙德军 冯建男 黎燕 沈倍奋 肖鹤 《中国实验血液学杂志》 CAS CSCD 2010年第6期1585-1589,共5页

本研究通过建立小鼠急性移植物抗宿主病(aGVHD)模型,研究aGVHD发病过程中补体系统的活化对病理过程的影响。选用近交系C57BL/6(H-2Kb)小鼠和BALB/c(H-2Kd)小鼠作为实验动物。模型组以前者作为供鼠,后者作为受鼠,给予受鼠8Gy60Coγ线全... 本研究通过建立小鼠急性移植物抗宿主病(aGVHD)模型,研究aGVHD发病过程中补体系统的活化对病理过程的影响。选用近交系C57BL/6(H-2Kb)小鼠和BALB/c(H-2Kd)小鼠作为实验动物。模型组以前者作为供鼠,后者作为受鼠,给予受鼠8Gy60Coγ线全身照射后4-6小时进行骨髓细胞+脾细胞移植;对照组为同基因移植组。通过观察小鼠的体表特征、生存期以及体重变化跟踪模型组动物aGVHD的发生发展。采用流式细胞术鉴定移植后模型小鼠的基因型;运用酶联免疫吸附试验(ELISA)从蛋白水平检测整个发病过程中器官组织C3a、C5a等补体相关成分的分泌表达,同时运用荧光定量PCR技术从基因水平检测补体相关基因的表达变化;通过苏木精伊红(HE)染色对aGVHD所导致的组织损伤进行病理学分析,同时利用免疫荧光(IF)等实验技术检测补体相关成分在发病小鼠相应器官组织中的沉积,初步探讨其与组织病理损伤的内在联系。结果表明:模型组小鼠表现出典型的aGVHD特征:食欲下降、体重减轻、皱毛、弓背、活动减少、脱毛等;与对照组相比,模型组小鼠靶器官(肝脏)组织中补体相关成分的表达无论从蛋白水平还是基因水平上均有明显升高(p<0.05);组织病理学分析结果显示,模型组小鼠的靶器官组织中(肝脏的中央静脉和门管区)有显著的炎性细胞浸润,并且在浸润部位有明显的补体成分C3的沉积。结论:在小鼠aGVHD发病过程中,肝组织中的补体系统持续性地过度活化,产生的补体相关成分沉积于受损的肝组织内,沉积部位有明显的炎性细胞浸润,这说明补体系统的过度活化可能与aGVHD所导致的病理损伤有密切联系。 展开更多

关键词 补体 补体活化 移植物抗宿主病

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牛胰脏RNA Ⅱ的制备

12

作者 赵轶卓 孙妙囡 孙德军 《吉林大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2007年第6期1101-1103,共3页

目的：改进从牛胰脏制备RNAⅡ的方法，以降低成本，减少污染排放，提高产品的质量和收率。方法：采用酶-苯酚-氯仿稀盐法，替代传统方法的大剂量苯酚多次萃取法从牛胰脏提取RNAⅡ。结果：采用酶-苯酚-氯仿-稀盐法制备的RNAⅡ，制剂A260... 目的：改进从牛胰脏制备RNAⅡ的方法，以降低成本，减少污染排放，提高产品的质量和收率。方法：采用酶-苯酚-氯仿稀盐法，替代传统方法的大剂量苯酚多次萃取法从牛胰脏提取RNAⅡ。结果：采用酶-苯酚-氯仿-稀盐法制备的RNAⅡ，制剂A260／A230、A260／A280的比值分别达到2．1和1．9以上，传统工艺为1．44和1．63；DNA含量控制在2％以下，传统工艺为6．2％；有机试剂消耗降低明显，由传统工艺的18000mL苯酚·kg^-1牛胰脏降低到600和300mL氯仿·kg^-1牛胰脏；成本由原来的253元·g^1牛胰脏核糖核酸降到11～14元·g^1牛胰脏核糖核酸。结论：采用酶-苯酚-氯仿-稀盐法制备的RNAⅡ中蛋白、多糖含量较低，纯度较传统方法有较大提高；该方法可减少有机试剂用量，减少污染排放，使生产成本大幅度下降；本工艺适合大规模生产RNAⅡ。 展开更多

关键词 RNAⅡ 牛胰脏 酶-苯酚氯仿-稀盐法

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一种表现为皮肤胶原沉着病的小鼠慢性移植排斥模型的建立 被引量：2

13

作者 侯春梅 张及禄 +5 位作者 高小飞 李新颖 冯健男 沈倍奋 黎燕 肖鹤 《军事医学》 CAS CSCD 北大核心 2011年第8期599-602,共4页

目的建立一种小鼠慢性移植排斥模型。方法将6～8周龄BALB/c(雌性)小鼠经6 Gy60Co全身照射后随机分为同基因移植组和异基因移植组。异基因组尾静脉输注未经照射的B10.D2(雄性)小鼠的骨髓细胞和脾细胞的混合悬液。移植术后通过小鼠性染色... 目的建立一种小鼠慢性移植排斥模型。方法将6～8周龄BALB/c(雌性)小鼠经6 Gy60Co全身照射后随机分为同基因移植组和异基因移植组。异基因组尾静脉输注未经照射的B10.D2(雄性)小鼠的骨髓细胞和脾细胞的混合悬液。移植术后通过小鼠性染色体基因组检测、组织病理学分析,以及流式细胞仪和实时定量PCR检测确定小鼠病变的发生。结果病理学分析显示,异基因组小鼠主要表现为皮肤损伤,与同基因组相比,皮肤明显增厚,皮肤弹性降低,真皮层炎性细胞浸润,毛囊和脂肪减少或消失,大量的纤维组织增生,皮下组织出现明显结构改变;性染色体基因组分析显示,异基因组受者小鼠皮肤内有供者小鼠细胞的浸润;流式结果显示,异基因组小鼠皮肤内CD11b、CD45和CD3表达明显增强;实时定量PCR检测结果显示,异基因组小鼠皮肤RANTES、TGF-β1以及胶原蛋白ⅠmRNA水平明显升高。结论与同基因组小鼠相比,异基因组小鼠表现为皮肤胶原沉着病损伤;CD11b+、CD45+和CD3+细胞以及趋化因子RANTES和细胞因子TGF-β1参与了这一病理过程的发生。本研究建立了一种表现为皮肤胶原沉着病的小鼠慢性移植排斥反应模型,为相关后续研究提供了有益的基础。 展开更多

关键词 移植物排斥 皮肤胶原沉着病 动物模型

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蜂毒明肽的原核表达及纯化 被引量：2

14

作者 朱文赫 王涵 +1 位作者 孙妙囡 孙德军 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2009年第10期971-974,共4页

目的原核表达并纯化蜂毒明肽。方法人工合成蜂毒明肽基因,与肠激酶识别序列基因串联,插入原核表达载体pGEX-2T中,构建蜂毒明肽与谷胱甘肽硫转移酶的融合表达载体pGEX-APAM。将重组质粒转化E. coli BL21(DE3),IPTG诱导表达,表达产物经SDS... 目的原核表达并纯化蜂毒明肽。方法人工合成蜂毒明肽基因,与肠激酶识别序列基因串联,插入原核表达载体pGEX-2T中,构建蜂毒明肽与谷胱甘肽硫转移酶的融合表达载体pGEX-APAM。将重组质粒转化E. coli BL21(DE3),IPTG诱导表达,表达产物经SDS-PAGE和Western blot鉴定,并进行纯化和肠激酶切割。结果经Western blot鉴定,表达产物具有良好的反应原性。在优化的表达条件下,融合蛋白的表达量约占菌体总蛋白的25.8%,且大部分以可溶性形式存在。纯化的融合蛋白纯度大于95%,每毫克融合蛋白经肠激酶切割后,可得蜂毒明肽58.5μg,回收率为81.9%。结论已成功地原核表达并纯化了蜂毒明肽。 展开更多

关键词 蜂毒明肽 原核表达 纯化

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