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基于PCR指纹技术鹿鞭鉴定方法的建立及检测试剂盒的研制 被引量：2
1
作者 王雪松 艾金霞 +5 位作者 薛晗 孙丽媛 王艳双 周亭亭 李明成 张丽华 《吉林医药学院学报》 2021年第1期1-5,共5页
目的建立鹿鞭及其伪品指纹鉴定方法,开发鹿鞭DNA检测试剂盒。方法采用改良的SDS方法从鹿鞭及牛鞭基因组中提取DNA。以鹿鞭线粒体细胞色素b作为靶基因,设计鹿鞭特异性引物,利用现代DNA指纹技术,研制了鹿鞭DNA提取和检测试剂,建立鹿鞭指... 目的建立鹿鞭及其伪品指纹鉴定方法,开发鹿鞭DNA检测试剂盒。方法采用改良的SDS方法从鹿鞭及牛鞭基因组中提取DNA。以鹿鞭线粒体细胞色素b作为靶基因,设计鹿鞭特异性引物,利用现代DNA指纹技术,研制了鹿鞭DNA提取和检测试剂,建立鹿鞭指纹鉴定方法,开发出鹿鞭DNA检测试剂盒。结果利用PCR指纹技术提取的鹿鞭基因组DNA为21000 bp,纯度为1.80±0.10之间;应用特异性引物可准确鉴别鹿鞭及牛鞭样品,鹿鞭特异性扩增产物DNA分子片段为307 bp,而牛鞭及阴性对照无扩增条带;自主研发鹿鞭DNA检测试剂盒经反复冻融依然有效,多次进行特异性、稳定性和重现性试验,结果完全一致。结论鹿鞭DNA检测试剂盒可作为鹿鞭鉴定的有效方法,该方法客观、准确、方便,可有效区分鹿鞭及其伪品。 展开更多
关键词 鹿鞭 牛鞭 细胞色素B DNA检测试剂盒 PCR指纹技术
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基于双重PCR技术的鹿茸及其伪品DNA指纹特征和鉴定 被引量：12
2
作者 高丽君 何程远 +7 位作者 李盈诺 巴宏宇 李梓僮 夏薇 李明成 苑广信 张丽华 艾金霞 《吉林大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2018年第4期839-844,共6页
目的:分析鹿茸线粒体细胞色素b(Cytb)和细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ(COⅠ)基因特异性,建立双重PCR技术鉴别鹿茸真伪的分子指纹特征。方法:利用碱变性法提取梅花鹿茸、马鹿茸、驯鹿茸和新西兰鹿茸的基因组DNA,应用引物设计软件Premier 5.0针对... 目的:分析鹿茸线粒体细胞色素b(Cytb)和细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ(COⅠ)基因特异性,建立双重PCR技术鉴别鹿茸真伪的分子指纹特征。方法:利用碱变性法提取梅花鹿茸、马鹿茸、驯鹿茸和新西兰鹿茸的基因组DNA,应用引物设计软件Premier 5.0针对Cytb和COⅠ分别设计特异性引物(分别为Cytb 1、2和COⅠ1、2、3),采用单一及双重引物分别进行PCR扩增,筛选特异性强的引物,确定最佳PCR反应条件。结果:采用碱变性法提取的鹿茸基因组DNA片段长度为23 000bp,DNA纯度即A(260)/A(280)为1.80±0.02;应用单一引物进行PCR扩增无法鉴定鹿茸的真伪,而引物Cytb 1和COⅠ1组合后,解链温度为58℃时,梅花鹿茸(吉林、安徽)、马鹿茸均能扩增出395和525bp大小的2个片段,而驯鹿茸和新西兰鹿茸均未能扩增出相应片段;采用该提取方法及最优化的PCR反应条件,对市售样品进行检测,检测结果与实际情况完全一致。结论:双重PCR技术可从分子水平鉴别鹿茸的真伪,该方法特异性高、实用性强,且简便快捷,在鹿茸真伪鉴别方面具有较高的应用价值。 展开更多
关键词 鹿茸 细胞色素B 细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ 双重聚合酶链反应 DNA指纹
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牛肉PCR-核酸试纸条快速鉴定方法的建立及试剂盒的研制 被引量：13
3
作者 姜海瀛 张志杰 +5 位作者 王艳双 张莉 高丽君 李明成 孙丽媛 张丽华 《食品与发酵工业》 CAS CSCD 北大核心 2021年第18期275-281,共7页
该研究建立肉类食品中牛肉PCR-核酸试纸条快速鉴定方法,并开发快速检测试剂盒。对国家标准中牛的特异性引物进行标记,研发牛肉DNA快速提取试剂和基因检测试剂,采用核酸试纸条进行可视化检测;应用分子克隆及测序技术,克隆牛肉标准品;并... 该研究建立肉类食品中牛肉PCR-核酸试纸条快速鉴定方法,并开发快速检测试剂盒。对国家标准中牛的特异性引物进行标记,研发牛肉DNA快速提取试剂和基因检测试剂,采用核酸试纸条进行可视化检测;应用分子克隆及测序技术,克隆牛肉标准品;并对试剂的特异性、重现性、稳定性及灵敏度进行考察。提取基因组DNA的方法简单、快速,DNA的完整性、浓度及纯度均非常好;退火温度59℃、在20个循环时试纸条检测结果最特异,牛肉正品均出现2条条带,易混品及空白对照均出现1条条带。克隆测序后的牛肉DNA序列与牛线粒体DNA特异指纹区段序列同源性100%。自主研发的试剂盒特异性、重现性、稳定性良好,模板DNA最低检出量为1 pg/μL。该研究建立的PCR-核酸试纸条方法特异性强、灵敏、准确、简便、快速;研制的试剂盒操作简便快速、结果可视稳定,适用于实地监测。 展开更多
关键词 PCR 核酸试纸条 牛肉 快速检测试剂盒 分子克隆 测序
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中药材蛤蚧PCR-试纸条快速分子鉴定方法及检测试剂的研究
4
作者 王艺潼 马梓宸 +2 位作者 王艳双 母润红 张丽华 《中国药学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2023年第24期2274-2281,共8页
目的建立中药材蛤蚧聚合酶链反应(PCR)-免疫胶体金试纸条快速分子鉴定方法,研发快速基因检测试剂盒。方法筛选提取基因组DNA的方法及试剂,根据蛤蚧mtDNA cytb基因设计种属特异性引物并标记,筛选最佳反应条件,研发PCR基因检测试剂,采用... 目的建立中药材蛤蚧聚合酶链反应(PCR)-免疫胶体金试纸条快速分子鉴定方法,研发快速基因检测试剂盒。方法筛选提取基因组DNA的方法及试剂,根据蛤蚧mtDNA cytb基因设计种属特异性引物并标记,筛选最佳反应条件,研发PCR基因检测试剂,采用分子克隆及基因测序技术制备对照药材DNA克隆液,利用免疫胶体金试纸条进行结果检测。进而,开发出一体化快速基因检测试剂盒,并对特异性、重现性、灵敏性、稳定性进行评价。结果基因组DNA的完整性、浓度、纯度均满足PCR的要求,引物在退火温度63℃时,循环20次时,免疫胶体金试纸条显示:蛤蚧对照药材及正品出现两条红色条带,易混品及空白对照出现一条红的条带。琼脂糖凝胶电泳验证正确。对照药材克隆测序结果于蛤蚧mtDNA cytb基因同源性100%。一体化快速基因检测试剂盒的特异性强、重现性好、稳定性好、灵敏度高于琼脂糖凝胶电泳10倍。结论PCR-免疫胶体金试纸条鉴定方法能够特异、准确、快速、可视化地鉴定蛤蚧的真伪,一体化快速检测试剂盒使鉴定方法更加规范化、标准化,更适合实地现场检测、适合普遍推广使用。 展开更多
关键词 蛤蚧 聚合酶链反应 免疫胶体金试纸条 分子克隆 基因测序
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基于“遗传标志物”紫河车DNA指纹-试纸条分子鉴定方法及试剂的研究
5
作者 王艳双 王艺潼 +1 位作者 母润红 张丽华 《药物分析杂志》 CAS CSCD 北大核心 2024年第7期1276-1284,共9页
目的:建立中药材紫河车遗传标志物DNA指纹-免疫胶体金试纸条快速分子鉴定方法,研发一体化质量控制基因检测试剂盒。方法:自主研发紫河车模板DNA提取的方法及试剂,根据人mtDNA cytb基因设计种属特异性引物,引物的5'端分别用FAM、Bio... 目的:建立中药材紫河车遗传标志物DNA指纹-免疫胶体金试纸条快速分子鉴定方法,研发一体化质量控制基因检测试剂盒。方法:自主研发紫河车模板DNA提取的方法及试剂,根据人mtDNA cytb基因设计种属特异性引物,引物的5'端分别用FAM、Biotin标记,筛选PCR最佳退火温度及循环次数,建立DNA指纹分子鉴定方法,研发PCR基因检测试剂预混液,采用分子克隆及基因测序技术制备对照药材DNA克隆液,利用免疫胶体金试纸条进行结果检测,开发出集“DNA提取试剂、PCR基因检测试剂预混液、对照药材DNA克隆液、空白对照液、试纸条”为一体的快速基因检测试剂盒,并进行特异性、重现性、灵敏性、稳定性的评价。结果:自主研发的DNA提取试剂提取的模板DNA质量浓度均在150~280 ng·μL^(-1),纯度均在1.8~1.9,琼脂糖凝胶电泳无拖尾。紫河车特异性引物在退火温度59℃、循环20次时;免疫胶体金试纸条显示:紫河车对照药材及正品出现2条红色条带,易混品及空白对照出现1条红的条带。琼脂糖凝胶电泳验证正确。对照药材DNA测序结果与人mtDNA cytb基因同源性100%。自主研发的一体化快速基因检测试剂盒的特异性强,重现性好,稳定性好,灵敏度为0.1 ng·μL^(-1)。结论:DNA指纹-免疫胶体金试纸条分子鉴定方法能够特异、准确、快速、可视化地对紫河车的真伪进行鉴定,一体化快速基因检测试剂盒为紫河车质量控制提供规范化、标准化的检测方式,更适合现场实地检测,可普遍推广使用。 展开更多
关键词 紫河车 遗传标志物 线粒体细胞色素B基因 PCR技术 DNA指纹 免疫胶体金试纸条 一体化试剂盒
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中药材鹿心分子鉴定方法及检测试剂的研究 被引量：6
6
作者 王艳双 姜海瀛 +5 位作者 刘美琳 高丽君 李明成 孙丽媛 张丽华 艾金霞 《中草药》 CAS CSCD 北大核心 2021年第2期544-551,共8页
目的建立中药材鹿心DNA指纹鉴定方法,研发鹿心DNA检测试剂盒。方法以梅花鹿和马鹿mtDNA Cytb基因作为靶基因,设计小片段特异性引物,研制鹿心DNA提取及PCR检测试剂;应用分子克隆及测序技术,克隆鹿心对照药材;并对试剂的特异性、重现性、... 目的建立中药材鹿心DNA指纹鉴定方法,研发鹿心DNA检测试剂盒。方法以梅花鹿和马鹿mtDNA Cytb基因作为靶基因,设计小片段特异性引物,研制鹿心DNA提取及PCR检测试剂;应用分子克隆及测序技术,克隆鹿心对照药材;并对试剂的特异性、重现性、稳定性及灵敏度进行考察;对市售鹿心样品进行真伪鉴定。结果自主研发的试剂提取鹿心的DNA浓度纯度均达到PCR的要求;在退火温度为63℃时引物的特异性最强;克隆测序后的鹿心DNA序列与鹿心mtDNA Cytb特异指纹区段序列一致;自主研发的试剂重现性、稳定性良好,灵敏度达到0.5%;对市售30个鹿心样品进行检测,伪品率为40%。结论建立的鹿心DNA指纹鉴定方法特异、准确、可靠,研制的鹿心DNA检测试剂盒操作简便、结果稳定。 展开更多
关键词 鹿心 DNA指纹鉴定 DNA检测试剂盒 分子克隆 测序技术
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鹿茸DNA检测试剂盒的研制与评价 被引量：5
7
作者 徐岩 翟英南 +6 位作者 段思琪 李明成 高丽君 孙丽媛 王艳双 李丹 刘桐辉 《中国药学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2020年第11期889-894,共6页
目的本实验对名贵中药材鹿茸的DNA指纹特征进行研究,从分子水平鉴定及分析鹿茸,研发鹿茸DNA检测试剂盒,并对其进行性能评价。方法以鹿茸细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ(CoⅠ)和鹿茸线粒体细胞色素b(cytochrome b,Cyt b)为靶基因,采用生物信息学... 目的本实验对名贵中药材鹿茸的DNA指纹特征进行研究,从分子水平鉴定及分析鹿茸,研发鹿茸DNA检测试剂盒,并对其进行性能评价。方法以鹿茸细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ(CoⅠ)和鹿茸线粒体细胞色素b(cytochrome b,Cyt b)为靶基因,采用生物信息学技术设计5对特异性引物,经实验筛选后确定细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ1,即mt DNA CoⅠ1(NC_013834.1)为特异性最好的引物,对鹿茸样品通过聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)进行扩增,优化PCR反应体系及反应条件,研发出鹿茸DNA检测试剂盒。对其性能进行评价,并对市售鹿茸样品进行检测。结果使用鹿茸DNA检测试剂盒提取的DNA纯度均在1.785~1.906内,该试剂盒的特异性体现在检测正品时出现条带,而伪品无条带;灵敏度达3.125 ng·μL-1;反复冻融5、10、15、20次后仍有效用;重复检测正、伪品3次,结果均一致;-20℃保存,有效期可长达1年。对5个地区12个市售样品进行质量分析,合格率为66.67%。结论研发的鹿茸DNA检测试剂盒特异性强、灵敏度高、稳定性及重复性均良好,操作简单,检测样品微量,适用范围广,成本低廉,结果准确,可为中药鹿茸提供一种科学、准确、可靠的鉴定方法。同时也表明市售鹿茸样品质量良莠不齐,混伪品大量充斥。 展开更多
关键词 分子生物学 鹿茸 试剂盒 评价
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应用PCR-RFLP方法鉴定梅花鹿茸与马鹿茸 被引量：17
8
作者 徐岩 邵博宇 +8 位作者 徐宁 翟英南 高锋 艾金霞 张亚丽 李明成 李丹 高丽君 夏薇 《中国药学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2020年第24期2021-2028,共8页
目的建立一种应用限制性片段长度多态性技术鉴别梅花鹿茸与马鹿茸的方法。方法提取各种鹿茸样品的基因组DNA,通过聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)对正品鹿茸的特异性片段进行扩增,鉴别鹿茸的真伪,然后对正品鹿茸利用动... 目的建立一种应用限制性片段长度多态性技术鉴别梅花鹿茸与马鹿茸的方法。方法提取各种鹿茸样品的基因组DNA,通过聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)对正品鹿茸的特异性片段进行扩增,鉴别鹿茸的真伪,然后对正品鹿茸利用动物通用引物进行PCR扩增,并通过限制性片段长度多态性分析进一步对正品鹿茸的种属来源进行确证。结果通过对特异性片段的PCR扩增,可将梅花鹿茸及马鹿茸与驯鹿、麋鹿、新西兰鹿等伪品鹿茸加以区分,通过对限制性内切酶Msp I进行酶切后的片段长度进行分析,可进一步区分梅花鹿茸与马鹿茸。结论本实验建立了一种基于限制性片段长度多态性技术快速、准确的鉴别鹿茸真伪及种属鉴定的方法,为解决中药易混品种难以鉴定的问题提供了又一个新方法。 展开更多
关键词 鹿茸 限制性片段长度多态性 聚合酶链式反应 种属鉴别
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