抗肺癌单克隆抗体15A1的靶抗原在肺癌细胞中的表达及其转位特征 被引量：4

1

作者 孙立新 冉宇靓 +5 位作者 杨薇薇 孙力超 张晓艳 容雁 刘军 杨治华 《中国肿瘤生物治疗杂志》 CAS CSCD 北大核心 2011年第2期133-138,共6页

目的:分析抗肺癌单克隆抗体15A1的靶抗原在肺癌细胞的表达、亚细胞定位和转位的特征,研究15A1的体内外抑瘤功能,为肺癌靶向治疗提供候选抗体药物及靶标。方法:采用免疫荧光及细胞流式术检测单克隆抗体15A1靶抗原在肺癌细胞中的表达及定... 目的:分析抗肺癌单克隆抗体15A1的靶抗原在肺癌细胞的表达、亚细胞定位和转位的特征,研究15A1的体内外抑瘤功能,为肺癌靶向治疗提供候选抗体药物及靶标。方法:采用免疫荧光及细胞流式术检测单克隆抗体15A1靶抗原在肺癌细胞中的表达及定位,免疫组化分析其在人肺癌组织中的表达;CCK-8法和裸鼠移植瘤体内抗体抑瘤实验评估该单克隆抗体对肺癌细胞的抑制作用。结果:单克隆抗体15A1识别的抗原在人肺腺癌细胞(A549、ANIP-973、GLC-82、Calu-3、H157、H1299)、人肺鳞癌细胞(GLC-P、H520)、人小细胞肺癌细胞(H446、H209)、人大细胞肺癌细胞(PG、H460)共12种细胞的胞内及胞膜上均有表达,肺腺癌细胞的表达强度明显高于其他病理类型肺癌细胞;该抗原在75%的人肺癌组织中非常特异地上调表达。该抗原在肺腺癌细胞中相当一部分从胞核转位至胞质,在肺鳞癌细胞中仅有小部分从细胞核转位至细胞质;转位抗原的一部分表达于膜表面,并同样是肺腺癌细胞的表达强度强于肺鳞癌细胞。该单克隆抗体体内外显著抑制肺癌细胞的生长,抑瘤率在25%～80%。结论:单克隆抗体15A1在体内外能显著抑制肺癌的生长,其靶抗原在人肺癌组织和细胞中特异上调表达,并能以特定转位模式表达于肺癌细胞膜上,可能是一个肺癌靶向治疗的潜在靶标。 展开更多

关键词 肺癌 功能性单克隆抗体 靶抗原 靶向治疗 转位 靶标

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重组白细胞抑制因子和水蛭肽嵌合蛋白工程菌的高密度发酵 被引量：3

2

作者 冀成法 马鲁南 +4 位作者 柳常青 滕学东 邵明学 刘忠 张贵民 《生物加工过程》 CAS 2021年第3期250-255,共6页

重组白细胞抑制因子和水蛭肽嵌合蛋白(TNHH)是治疗用生物制品Ⅰ类新药,具有多种功效,可用于治疗脑卒中。本文旨在优化TNHH工程菌发酵工艺,以实现该工程菌的高密度发酵和目的蛋白的高效表达。笔者采用摇瓶试验和发酵罐发酵,从培养基碳、... 重组白细胞抑制因子和水蛭肽嵌合蛋白(TNHH)是治疗用生物制品Ⅰ类新药,具有多种功效,可用于治疗脑卒中。本文旨在优化TNHH工程菌发酵工艺,以实现该工程菌的高密度发酵和目的蛋白的高效表达。笔者采用摇瓶试验和发酵罐发酵,从培养基碳、氮源配比正交试验入手,对工程菌生长和目的蛋白表达影响较大的单因子条件进行重点考察,如温度、pH、诱导策略、诱导剂和抗生素替代及补料流加方式。通过优化,6批50 L发酵工艺稳定,菌体密度(OD 600)均能达79以上,目的蛋白表达量均在30%以上,质粒丢失率均低于10%。优化后的发酵工艺稳定,产量提高258%,质粒丢失率保持在10%以内,为TNHH项目进一步大规模生产奠定了基础。 展开更多

关键词 脑卒中 TNHH 大肠杆菌 高密度发酵 质粒丢失率 水蛭肽

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抗胰腺癌干细胞单克隆抗体的筛选和鉴定

3

作者 孙立新 遇珑 +5 位作者 解亦斌 莫文秀 刘辉琦 杨治华 冉宇靓 孙力超 《现代肿瘤医学》 CAS 2014年第7期1492-1496,共5页

目的:从抗胰腺癌干细胞单抗库中筛选、鉴定识别胰腺癌干细胞的功能性单抗,为胰腺癌干细胞靶向治疗提供候选抗体药物。方法:无血清悬浮培养及PKH26染色确定胰腺癌HPAC细胞系中肿瘤干细胞的存在。流式细胞术检测HPAC的干细胞标志物CD133... 目的:从抗胰腺癌干细胞单抗库中筛选、鉴定识别胰腺癌干细胞的功能性单抗,为胰腺癌干细胞靶向治疗提供候选抗体药物。方法:无血清悬浮培养及PKH26染色确定胰腺癌HPAC细胞系中肿瘤干细胞的存在。流式细胞术检测HPAC的干细胞标志物CD133在球体细胞中的阳性比例,检测20株杂交瘤单抗在HPAC亲本和球体细胞中的阳性表达。双色荧光标记流式细胞术检测CD133和单抗在HPAC亲本和球体细胞中的共表达比例;无血清悬浮培养法观察单抗15E9对HPAC成球细胞自我更新的影响。CCK-8法检测单抗15E9对HPAC细胞增殖和耐药的影响。结果:HPAC细胞能在无血清培养基中存活、增殖并形成细胞球,成球率为4.8%±0.6%。HPAC球体细胞中CD133+细胞的比例较亲本细胞提高至11.6倍。20株候选杂交瘤单抗中有3株单抗能识别HPAC球体细胞中CD133+细胞,其中单抗15E9共染比例为3.5%,并能显著抑制HPAC细胞的成球,抑制率达到30.4%。单抗15E9联合吉西他滨能显著抑制HPAC球体细胞的增殖,联合组和对照组IC50分别为30.8nmol/L和58.1nmol/L。结论:本研究成功筛选出1株杂交瘤单抗可以识别胰腺癌干细胞,并且可识别CD133+的胰腺癌干细胞;体外功能显示该抗体具有抑制HPAC干细胞的自我更新能力,抗体干预后显著降低HPAC耐药能力,可能是潜在的胰腺癌干细胞的靶向治疗抗体药物。 展开更多

关键词 胰腺癌 肿瘤干细胞 单克隆抗体 靶向治疗 CD133

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人肺腺癌A549细胞系干细胞样细胞的培养检测及其抗顺铂能力的研究 被引量：1

4

作者 马晓雯 刘彤 +3 位作者 孙力超 刘军 杨治华 冉宇靓 《广西医科大学学报》 CAS 2011年第2期187-191,共5页

目的:从人肺腺癌A549细胞系中培养获得含干细胞样细胞的球细胞(Sphere细胞),检测相关标志物表达及其对顺铂的耐药性。方法:采用含特定生长因子的无血清培养基诱导A549细胞的Sphere细胞形成,用亲脂荧光染料标记技术和免疫荧光法检测Spher... 目的:从人肺腺癌A549细胞系中培养获得含干细胞样细胞的球细胞(Sphere细胞),检测相关标志物表达及其对顺铂的耐药性。方法:采用含特定生长因子的无血清培养基诱导A549细胞的Sphere细胞形成,用亲脂荧光染料标记技术和免疫荧光法检测Sphere细胞中干细胞的存在,用流式细胞术检测干性标志物CD133,OCT4,CD56,CD117在Sphere细胞中的表达,用CCK8法检测顺铂处理后A549细胞及Sphere细胞的耐药性,并计算IC50。结果:A549细胞的Sphere细胞中含不对称分裂的干性标志物阳性细胞,且多种干性标志物表达比例升高,对顺铂耐药性也显著提高(P<0.05)。结论:人肺腺癌细胞系A549细胞在特定培养条件下可形成富集了干细胞样细胞的Sphere细胞,并对顺铂的抵抗能力增强。 展开更多

关键词 人肺腺癌细胞 A549细胞 球细胞 顺铂耐药性

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血小板生成素对免疫性血小板减少小鼠脾脏T淋巴细胞亚群的影响 被引量：7

5

作者 姜明敏 李玉婷 +2 位作者 王丽娟 潘思娜 姚景春 《免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2019年第8期671-676,共6页

目的探讨血小板生成素(TPO)对免疫性血小板减少(immune thrombocytopenia,ITP)小鼠脾脏T淋巴细胞极化的影响。方法将野生型ICR小鼠随机分为正常组、模型组、TPO组。模型组与TPO组小鼠腹腔注射(ip)抗小鼠CD41抗体(MWReg30),连续造模7d。... 目的探讨血小板生成素(TPO)对免疫性血小板减少(immune thrombocytopenia,ITP)小鼠脾脏T淋巴细胞极化的影响。方法将野生型ICR小鼠随机分为正常组、模型组、TPO组。模型组与TPO组小鼠腹腔注射(ip)抗小鼠CD41抗体(MWReg30),连续造模7d。造模第1天起,TPO组连续9d皮下注射(sc)3600 U/kg重组人TPO注射液,正常组与模型组皮下注射等体积PBS。给药结束24 h后麻醉动物,取血,测血常规;取脾脏,计算脾脏指数;取脾脏细胞,流式细胞术检测辅助性T淋巴细胞(Th)、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)、1型辅助性T淋巴细胞(Th1)、2型辅助性T淋巴细胞(Th2)、17型辅助性T淋巴细胞(Th17)、调节性T淋巴细胞(Treg)、滤泡辅助性T淋巴细胞(Tfh)比例。结果与正常组相比,模型组小鼠脾脏指数、Th1、Th17、Tfh、CTL/Th及Th1/Th2比值均显著升高,而外周血小板数量、Th2、Treg、Treg/Th17比例均显著降低;与模型组相比,TPO组小鼠脾脏指数、Th1、Tfh、CTL/Th、Th1/Th2比值均显著降低,外周血小板数量、Th2、Treg、Treg/Th17比值均显著升高,Th17比例变化不显著。结论 TPO治疗ITP还与其调节脾脏T淋巴细胞亚群比例相关。 展开更多

关键词 血小板生成素 免疫性血小板减少 脾脏 T淋巴细胞

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高效液相色谱法测定司美格鲁肽原料药中游离脂肪酸侧链的含量

6

作者 杨庆 马鲁南 +2 位作者 刘忠 曹宇 张贵民 《中南药学》 CAS 2023年第1期199-202,共4页

目的建立高效液相色谱法检测司美格鲁肽原料药中的游离脂肪酸侧链[(S)-9,18,23-三氧代-2,5,11,14-四氧杂-8,17,22-三氮杂三十九烷-1,21,39-三羧酸]的含量。方法采用Kinetex C8(4.6 mm×150 mm,2.6μm)色谱柱;流动相A为0.1%三氟乙酸... 目的建立高效液相色谱法检测司美格鲁肽原料药中的游离脂肪酸侧链[(S)-9,18,23-三氧代-2,5,11,14-四氧杂-8,17,22-三氮杂三十九烷-1,21,39-三羧酸]的含量。方法采用Kinetex C8(4.6 mm×150 mm,2.6μm)色谱柱;流动相A为0.1%三氟乙酸-水溶液;流动相B为0.1%三氟乙酸-乙腈溶液;洗脱梯度(0 min,30%B;20 min,70%B;21min,30%B;30 min,30%B),流速0.7 mL·min^(-1);柱温35℃;检测波长210 nm。考察方法的专属性、线性范围、定量限与检测限、准确度和耐用性等。采用该方法检测3批司美格鲁肽原料药中的游离脂肪酸侧链含量。结果脂肪酸侧链与司美格鲁肽的分离度为4.05,在1.00~50.15μg·mL^(-1)与峰面积呈良好的线性关系,回归方程为Y=0.2584X-0.0936,R^(2)=0.9999;检测限和定量限分别为0.392μg·mL^(-1)和0.784μg·mL^(-1)。结论建立的方法具有良好的专属性和准确度,可用于司美格鲁肽原料药中游离脂肪酸侧链含量的测定。 展开更多

关键词 高效液相色谱法 司美格鲁肽 游离脂肪酸侧链

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实验设计法在优化表达Fc融合蛋白的CHO细胞发酵培养工艺中的应用 被引量：1

7

作者 马动 程凡亮 +2 位作者 刘忠 张贵民 赵丽丽 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2020年第1期66-70,75,共6页

目的通过实验设计(Design of Experiments,DOE)分析优化重组CHO细胞在生物反应器中的培养工艺。方法以2 L生物反应器控制参数温度(T)、pH及溶氧(dissolved oxygen,DO)作为变量,以蛋白表达量、蛋白纯度及蛋白唾液酸含量为响应变量,应用De... 目的通过实验设计(Design of Experiments,DOE)分析优化重组CHO细胞在生物反应器中的培养工艺。方法以2 L生物反应器控制参数温度(T)、pH及溶氧(dissolved oxygen,DO)作为变量,以蛋白表达量、蛋白纯度及蛋白唾液酸含量为响应变量,应用Design Expert 10软件进行3因素2水平DOE拟合分析,筛选最适表达Fc融合蛋白的CHO细胞发酵培养工艺参数,并采用5 L生物反应器进行验证。结果蛋白表达量仅与T有关,且呈成正相关,pH和DO对其无显著影响,T与pH对其有交互作用;蛋白纯度受T和pH影响显著,T呈负相关,pH呈正相关,DO对其无显著影响,T与pH对其有交互作用;唾液酸含量受T和pH影响显著,T呈正相关,pH呈负相关,DO对其无显著影响。最适工艺参数确定T为(34±0.5)℃,pH为(7.05±0.02),DO为(45±5)%。采用最适工艺参数的反应器与优化前工艺比较,活细胞密度(viable cell density,VCD)增加;蛋白表达量、蛋白纯度、唾液酸含量分别提高了29.7%、8%和87.9%。结论通过DOE方法快速优化了生物反应器培养表达Fc融合蛋白的CHO细胞的工艺参数,在不降低蛋白产量及纯度的前提下,极大提高了融合蛋白唾液酸含量。 展开更多

关键词 实验设计 唾液酸 FC融合蛋白 CHO细胞 蛋白纯度

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抗CEA F(ab')_2抗体在CHO细胞中的表达、纯化及鉴定 被引量：1

8

作者 孙立新 赵泽国 +3 位作者 遇珑 杨治华 孙力超 冉宇靓 《中国卫生检验杂志》 北大核心 2013年第6期1367-1370,共4页

目的:构建抗人癌胚抗原(carcinoembryonic antigen,CEA)小分子嵌合抗体Rch24 F(ab')2真核高效表达载体并在中国仓鼠卵巢细胞(Chinese Hamster Ovary Cell,CHO)中实现高产量表达,对Rch24 F(ab')2的生物学活性进行鉴定。方法:采用... 目的:构建抗人癌胚抗原(carcinoembryonic antigen,CEA)小分子嵌合抗体Rch24 F(ab')2真核高效表达载体并在中国仓鼠卵巢细胞(Chinese Hamster Ovary Cell,CHO)中实现高产量表达,对Rch24 F(ab')2的生物学活性进行鉴定。方法:采用DNA重组技术构建Rch24 F(ab')2真核高效表达载体,转染CHO-dhfr-细胞,通过提高MTX浓度进行基因扩增表达,夹心ELISA法测定抗体产量,筛选高表达细胞株,采用亲和纯化的方法从细胞培养上清中纯化Rch24 F(ab')2;采用SDS-PAGE鉴定分子量,采用Western blot、直接ELISA和细胞免疫荧光鉴定所表达的Rch24 F(ab')2的人源性和抗原结合活性。结果:成功构建了抗人CEA小分子嵌合抗体Rch24 F(ab')2的真核高效表达载体,MTX加压扩增表达后筛选获得高产克隆5C4,其抗体产量为32.3μg/ml;结果显示所分泌的主要为正确组装的Rch24 F(ab')2分子,分子量约110kD;West-ern blot、直接ELISA、细胞免疫荧光结果证明所表达的Rch24 F(ab')2含人抗体的恒定区,并特异地与肿瘤细胞表达的CEA结合。结论:成功地在真核细胞CHO中高效表达了具有良好的生物学活性的抗人CEA小分子嵌合抗体Rch24 F(ab')2。 展开更多

关键词 CEA 小分子嵌合抗体 高效表达 CHO

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一种检测纽莫康定B_(0)和C_(0)质量浓度的HPLC方法研究 被引量：3

9

作者 魏荣省 李旭娇 +3 位作者 李会会 李心怡 韩守暖 朱兵峰 《发酵科技通讯》 CAS 2021年第1期28-32,39,共6页

建立了一种高效液相色谱(HPLC)方法同时测定纽莫康定B_(0)和纽莫康定C_(0)的质量浓度,采用Waters XBridge Amide色谱柱,检测波长220 nm,以V(纯水)∶V(乙腈)为流动相,梯度洗脱。检测结果表明:纽莫康定B_(0)和C_(0)的质量浓度在定量限至40... 建立了一种高效液相色谱(HPLC)方法同时测定纽莫康定B_(0)和纽莫康定C_(0)的质量浓度,采用Waters XBridge Amide色谱柱,检测波长220 nm,以V(纯水)∶V(乙腈)为流动相,梯度洗脱。检测结果表明:纽莫康定B_(0)和C_(0)的质量浓度在定量限至400 mg/L范围内线性关系良好,定量限在0.1 mg/L左右,检测限在0.03 mg/L左右,纽莫康定B_(0)和C_(0)的平均回收率分别为99.2%和98.9%,重复性试验纽莫康定B_(0)和C_(0)质量浓度的RSD分别为0.39%和0.42%,纽莫康定B_(0)对照品溶液、纽莫康定C_(0)对照品溶液和供试品溶液在室温条件下24 h内稳定。 展开更多

关键词 纽莫康定B_(0) 纽莫康定C_(0) 质量浓度 高效液相色谱

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白细胞抑制因子和水蛭肽嵌合蛋白表达纯化及活性研究 被引量：2

10

作者 宫晓建 魏永永 +4 位作者 张苏 冀成法 马鲁南 刘忠 张贵民 《生物技术》 CAS 2021年第2期129-133,共5页

[目的]采用大肠杆菌表达白细胞抑制因子和水蛭肽嵌合蛋白,表达纯化后进行抗细胞黏附活性及抑制凝血酶活性的功能研究。[方法]将编码白细胞抑制因子和水蛭肽嵌合蛋白的基因构建到pET28a载体上,转化菌株Rosetta(DE3)并经IPTG诱导表达后分... [目的]采用大肠杆菌表达白细胞抑制因子和水蛭肽嵌合蛋白,表达纯化后进行抗细胞黏附活性及抑制凝血酶活性的功能研究。[方法]将编码白细胞抑制因子和水蛭肽嵌合蛋白的基因构建到pET28a载体上,转化菌株Rosetta(DE3)并经IPTG诱导表达后分别经镍柱和分子筛进一步纯化,使用实时细胞分析仪和血凝仪分别测定了白细胞抑制因子和水蛭肽嵌合蛋白的抗粘附活性及抗凝血活性。[结果]成功表达并纯化出白细胞抑制因子和水蛭肽嵌合蛋白,并测定了嵌合蛋白生化及细胞水平活性。[结论]白细胞抑制因子和水蛭肽嵌合蛋白在大肠杆菌中经IPTG诱导表达。经亲和层析和分子筛层析纯化,蛋白纯度达到90%以上,该蛋白同时具有抗细胞粘附及抗凝血双功能,为后续成药性开发奠定基础。 展开更多

关键词 TNHH 蛋白表达 蛋白纯化 活性

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纽莫康定杂质C_(0)的制备研究 被引量：1

11

作者 曾凡洲 刘志钰 +3 位作者 朱兵峰 王钦超 张贵民 魏荣省 《中国抗生素杂志》 CAS CSCD 北大核心 2022年第3期280-288,共9页

目的 为控制纽莫康定B_(0)的质量及为卡泊芬净的杂质传递研究提供物料,本研究对关键杂质纽莫康定C_(0)进行了制备。方法 通过发酵液提取工艺富集、高压液相制备色谱、减压浓缩、冷冻干燥,制备得到纽莫康定C_(0)干粉,并对其进行紫外吸收... 目的 为控制纽莫康定B_(0)的质量及为卡泊芬净的杂质传递研究提供物料,本研究对关键杂质纽莫康定C_(0)进行了制备。方法 通过发酵液提取工艺富集、高压液相制备色谱、减压浓缩、冷冻干燥,制备得到纽莫康定C_(0)干粉,并对其进行紫外吸收光谱、红外吸收光谱、核磁共振、质谱等分析和结构鉴定。结果 得到了色谱纯度99.19%、峰纯度999.4(DAD检测器)、热重3.05%的纽莫康定C_(0)干粉1.7395 g,其结构经过确证为纽莫康定C_(0)。结论 制备得到的纽莫康定C_(0),可作为质量研究对照品和杂质传递研究用物料,并对纽莫康定其他杂质的制备具有重要参考价值。 展开更多

关键词 纽莫康定C_(0)制备 高压液相制备色谱 结构确证

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高压制备纽莫康定B_(0)的中试研究 被引量：2

12

作者 曾凡洲 朱兵峰 +3 位作者 刘志钰 王钦超 张贵民 魏荣省 《发酵科技通讯》 CAS 2021年第1期33-39,共7页

为制得高纯度的纽莫康定B_(0),以给下游合成卡泊芬净提供物料,用单因素实验的方法,对流动相比例、上样量和洗脱流速等高压制备条件进行了优化,并对产品质量和制备液稳定性进行了分析,最终确定了V(二氯甲烷(工业))∶V(甲醇)∶V(水)=42∶9... 为制得高纯度的纽莫康定B_(0),以给下游合成卡泊芬净提供物料,用单因素实验的方法,对流动相比例、上样量和洗脱流速等高压制备条件进行了优化,并对产品质量和制备液稳定性进行了分析,最终确定了V(二氯甲烷(工业))∶V(甲醇)∶V(水)=42∶9∶1,上样量为11.4 g粗品,洗脱流速为480 mL/min。制备液保存温度为4℃,需7 d内处理完毕。通过该方法,可以得到质量分数95%以上的B_(0),并能有效将B_(0)异构体C_(0)降至0.05%以下,为卡泊芬净的合成研究提供了质量保证。 展开更多

关键词 高压制备 纽莫康定B_(0) 纽莫康定C_(0) 分离纯化 色谱纯度

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高密度接种强化CHO细胞培养工艺的研究

13

作者 赵丽丽 朱玉强 +3 位作者 徐凯 朱中松 张贵民 刘忠 《中国医药工业杂志》 EI CAS CSCD 2024年第11期1511-1518,共8页

为确定不同高密度接种对双特异性抗体表达量及质量的影响、强化双特异性抗体细胞培养工艺,分别以低、中、高密度[每1 mL分别含(10±1)×10^(6)、(15±1)×10^(6)和(20±1)×10^(6)个细胞]将双特异性抗体细胞接... 为确定不同高密度接种对双特异性抗体表达量及质量的影响、强化双特异性抗体细胞培养工艺,分别以低、中、高密度[每1 mL分别含(10±1)×10^(6)、(15±1)×10^(6)和(20±1)×10^(6)个细胞]将双特异性抗体细胞接种于3 L生物反应器,补料分批次培养,并评估不同接种密度对抗体表达量及质量的影响。结果表明,与较低的高密度接种相比,中等及较高的高密度接种强化工艺所得的抗体表达量提高至1.43 g/L,且抗体质量无显著差异。相同培养周期(16 d)内,在抗体质量不受影响和节约成本的前提下,接种密度应采用中等高密度,抗体表达量可提高到1.43 g/L,与常规工艺(0.79 g/L)相比提高了81%。随后将中等高密度接种强化工艺成功放大至30 L生物反应器,为后续抗体工艺开发提供了宝贵的经验。 展开更多

关键词 双特异性抗体 培养工艺 补料批次培养 放大培养

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一株抗胰腺癌干细胞单克隆抗体的鉴定及功能研究 被引量：1

14

作者 孙立新 解亦斌 +3 位作者 遇珑 杨治华 冉宇靓 孙力超 《肿瘤研究与临床》 CAS 2014年第9期577-582,共6页

目的 对一株抗胰腺癌干细胞单克隆抗体（简称：单抗）进行初步鉴定和体外功能研究,为靶向胰腺癌干细胞治疗胰腺癌提供候选单抗药物.方法 应用无血清悬浮培养及PKH26染色确定胰腺癌细胞系PANC-1中肿瘤干细胞的存在.流式细胞术检测PANC-1... 目的 对一株抗胰腺癌干细胞单克隆抗体（简称：单抗）进行初步鉴定和体外功能研究,为靶向胰腺癌干细胞治疗胰腺癌提供候选单抗药物.方法 应用无血清悬浮培养及PKH26染色确定胰腺癌细胞系PANC-1中肿瘤干细胞的存在.流式细胞术检测PANC-1细胞中有干细胞标志物CD44＋CD24＋的细胞比例.双色细胞免疫荧光检测CD24和单抗15D2识别的抗原蛋白在PANC-1细胞中的表达情况.无血清悬浮培养法观察单抗15D2对PANC-1成球细胞自我更新的影响.CCK-8法检测单抗15D2对PANC-1细胞增殖和耐药的影响.免疫组织化学检测单抗15D2识别的靶抗原在人胰腺癌、癌旁组织中的表达情况.结果 PANC-1细胞能在无血清培养液中存活、增殖并形成细胞球,成球率为（2.5±0.5）％.PANC-1球体细胞中CD44＋ CD24＋细胞的比例较亲本细胞提高了11.4倍,其中CD44＋ CD24＋细胞占CD24＋细胞的97％,在此体系中用CD24作为PANC-1细胞干细胞标志物.细胞免疫荧光结果显示单抗15D2识别的抗原分子在细胞膜上表达,并能与CD24在PANC-1细胞共定位.抗体体外功能研究发现,单抗15D2能显著抑制PANC-1细胞在无血清培养液中成球,抑制率达到22％.同时,单抗15D2联合吉西他滨能显著抑制PANC-1球体细胞的增殖,联合组和对照组IC50分别为0.10、0.39 μmol/L.免疫组织化学检测结果显示,单抗15D2所识别的抗原蛋白在76.9％（11/13）的人胰腺癌组织中表达阳性,而在癌旁组织中表达阳性率仅为10.0％（1/10）,差异有统计学意义（P＜0.05）.结论 抗胰腺癌干细胞单抗15D2体外能够显著抑制胰腺癌干细胞的自我更新和耐药能力,为胰腺癌干细胞的靶向治疗提供有应用价值的候选抗体药物. 展开更多

关键词 胰腺肿瘤 肿瘤干细胞 抗体 单克隆 CD24

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ADCC增强型Claudin18.2单克隆抗体的制备和体内外活性

15

作者 朱中松 彭伟 +2 位作者 刘忠 张贵民 赵丽丽 《中国医药工业杂志》 2025年第2期190-197,共8页

Claudin18.2抗体在胃癌治疗中具有巨大的潜力。然而,受限于其非人源序列和较弱的受体亲和力,已上市抗体的疗效和安全性仍有待改善。该研究通过杂交瘤筛选、抗体人源化和抗体依赖性细胞毒性(ADCC)作用的改造,获得了特异性结合Claudin18.... Claudin18.2抗体在胃癌治疗中具有巨大的潜力。然而,受限于其非人源序列和较弱的受体亲和力,已上市抗体的疗效和安全性仍有待改善。该研究通过杂交瘤筛选、抗体人源化和抗体依赖性细胞毒性(ADCC)作用的改造,获得了特异性结合Claudin18.2的单克隆抗体110E2A4-M2。随后,测定了抗体的ADCC和补体依赖性细胞毒性(CDC)活性,并在小鼠移植瘤模型中研究了其药效。结果显示,抗体110E2A4-M2的ADCC活性显著高于对照抗体IMAB362,且CDC活性未降低,在小鼠皮下移植瘤模型中表现出较强的抑瘤能力,肿瘤生长抑制率为52.35%。该研究为Claudin18.2抗体的开发提供了数据支持。 展开更多

关键词 胃癌 Claudin18.2单克隆抗体 杂交瘤技术 抗体人源化 抗体依赖性细胞毒性 基因工程

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重组大肠杆菌高密度、高表达研究进展 被引量：9

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作者 冀成法 刘忠 +1 位作者 马鲁南 张贵民 《生物技术》 CAS 2022年第2期246-251,共6页

高密度发酵因其节约、高效等诸多优点而成为近年来发酵工业重要的研究热点之一。要实现重组大肠杆菌高密度发酵,不仅要考虑工程菌自身的表达性能,还必须兼顾能促进基因工程菌生长和产物表达的最适培养条件,包括较佳的培养基组成、适宜... 高密度发酵因其节约、高效等诸多优点而成为近年来发酵工业重要的研究热点之一。要实现重组大肠杆菌高密度发酵,不仅要考虑工程菌自身的表达性能,还必须兼顾能促进基因工程菌生长和产物表达的最适培养条件,包括较佳的培养基组成、适宜的补料策略、培养温度、pH值、溶解氧等。该文就影响大肠杆菌高密度发酵的影响因子、工艺条件等进行综述,并探讨了大肠杆菌高密度发酵的工艺改进方向。 展开更多

关键词 高密度发酵 大肠杆菌 基因工程菌 工艺

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CD47胞外区蛋白的真核表达与多克隆抗体的制备 被引量：2

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作者 朱中松 赵丽丽 +2 位作者 王玲玲 张贵民 刘忠 《中国医药工业杂志》 CAS CSCD 北大核心 2019年第12期1439-1443,共5页

通过真核表达系统表达CD47胞外区融合蛋白,并免疫新西兰兔,制备多克隆抗体。构建CD47胞外区真核表达质粒pCHO1.0-CD47-mFc,转染CHO-S细胞,建立高效表达CD47胞外区融合蛋白的稳转细胞库,并表达CD47胞外区融合蛋白,通过protein G亲和色谱... 通过真核表达系统表达CD47胞外区融合蛋白,并免疫新西兰兔,制备多克隆抗体。构建CD47胞外区真核表达质粒pCHO1.0-CD47-mFc,转染CHO-S细胞,建立高效表达CD47胞外区融合蛋白的稳转细胞库,并表达CD47胞外区融合蛋白,通过protein G亲和色谱法纯化,SDS-PAGE和Western Blot方法进行鉴定,Fortebio测定蛋白浓度。结果显示,获得的CHO-S-CD47-mFc细胞库的表达量在322 mg/L,纯化后蛋白纯度大于92%,表达的CD47-mFc融合蛋白可同CD47抗体特异性结合;将此CD47-mFc蛋白免疫新西兰兔,多克隆抗血清的效价达到1∶102400。 展开更多

关键词 真核表达 CD47胞外区 抗体 细胞库

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分子体积排阻高效液相色谱法测定低浓度重组人源化抗BCMA/CD3双特异性抗体药物的浓度

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作者 廉开礼 崔岩 +4 位作者 彭伟 曹宇 刘忠 张贵民 赵丽丽 《药物分析杂志》 CAS CSCD 北大核心 2020年第8期1365-1370,共6页

目的:建立定量测定溶剂中低浓度重组人源化抗BCMA/CD3双特异性抗体药物浓度的分子体积排阻高效液相色谱法(SEC-HPLC法)。方法:采用TSKgel G3000SWxl(7.8 mm×300 mm,5μm)体积排阻色谱柱,高效液相紫外检测器在214 nm处测定抗体药物... 目的:建立定量测定溶剂中低浓度重组人源化抗BCMA/CD3双特异性抗体药物浓度的分子体积排阻高效液相色谱法(SEC-HPLC法)。方法:采用TSKgel G3000SWxl(7.8 mm×300 mm,5μm)体积排阻色谱柱,高效液相紫外检测器在214 nm处测定抗体药物吸收度。对SEC-HPLC法进行专属性、系统残留、线性、精密度、稳定性方法学验证,并使用该方法和紫外-可见分光光度法测定样品浓度,进行准确度分析。结果:SEC-HPLC法对抗体药物浓度的测定无干扰;在0.01~0.32 mg·mL^-1浓度范围内,SECHPLC法线性良好(相关系数R2=1.000);不同实验者不同时间使用该方法可准确测定抗体药物浓度,RSD均≤2.0%,回收率均处于90.0%~110.0%之间;-80℃反复冻融和2~8℃存放24 h后,SEC-HPLC法仍能准确测定抗体药物浓度,稳定性良好(RSD≤2.0%)。SEC-HPLC法能准确测定样品浓度,RSD≤2.0%,回收率均处于90.0%~110.0%之间,而紫外-可见分光光度法不能准确测定低浓度(0.01 mg·m L^-1)样品的浓度,RSD为5.7%,回收率为131.6%。结论:SEC-HPLC测定浓度法准确性和精密度良好,能准确测定溶媒剂中0.01~0.32 mg·mL^-1范围内抗体药物浓度,能避免紫外-可见分光光度法测定0.01 mg·mL^-1样品不准确的局限性,可作为测定低浓度重组人源化抗BCMA/CD3双特异性抗体药物浓度的有效方法之一。 展开更多

关键词 分子体积排阻高效液相色谱法(SEC-HPLC) 紫外-可见分光光度法 抗体药物 方法验证 浓度

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索马鲁肽原料中N-羟基琥珀酰亚胺残留量反相高效液相色谱检测方法的建立及验证

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作者 杨庆 马鲁南 +1 位作者 刘忠 张贵民 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2023年第1期85-88,共4页

目的建立检测索马鲁肽原料中N-羟基琥珀酰亚胺(N-hydroxy succinimide,NHS)残留量的反相高效液相色谱(reverse phase-high performance liquid chromatography,RP-HPLC)法,并进行验证。方法筛选色谱柱并优化流动相条件(磷酸盐浓度与有... 目的建立检测索马鲁肽原料中N-羟基琥珀酰亚胺(N-hydroxy succinimide,NHS)残留量的反相高效液相色谱(reverse phase-high performance liquid chromatography,RP-HPLC)法,并进行验证。方法筛选色谱柱并优化流动相条件(磷酸盐浓度与有机相比例),建立检测索马鲁肽原料中NHS残留量的RP-HPLC法,并验证方法的专属性、适用性、准确度、重复性和稳定性,确定线性范围及定量限、检测限。用建立的方法检测3批索马鲁肽中NHS含量。结果确定的色谱条件如下:色谱柱为CAPCELL PAK ADME(4.6 mm×150 mm,3μm);流动相A为0.05 mol/L磷酸二氢钾溶液-乙腈(98∶2),流动相B为70%乙腈溶液;洗脱梯度为0 min 0%B,10 min 0%B,19 min 90%B,19.1 min 0%B,25 min 0%B;流速为0.8 mL/min;检测波长为260 nm;柱温为30℃。建立的方法在0.2~3.0μg/mL范围内与峰面积呈良好的线性关系,R^(2)=1.0000,检测限和定量限分别为4.8和9.6 ng;专属性、系统适用性良好;3种不同浓度NHS加样样品回收率的相对标准偏差(RSD)为0.58%,准确度良好;6份供试品溶液中NHS含量的RSD为0.16%,重复性良好;室温放置0、4、8、12、16、20和24 h NHS峰面积的RSD为0.34%,稳定性良好。3批索马鲁肽中均未检出NHS。结论建立的RP-HPLC法简单、灵敏度高,可用于索马鲁肽原料中NHS含量的测定。 展开更多

关键词 反相高效液相色谱法 N-羟基琥珀酰亚胺 索马鲁肽

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杜拉鲁肽类似药(27C7)的蛋白表达及理化性质分析

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作者 赵丽丽 谢艺嘉 +3 位作者 王玲玲 朱中松 张贵民 刘忠 《药物评价研究》 CAS 2020年第2期237-241,共5页

目的真核表达杜拉鲁肽类似药胰高糖素样肽l(GLP-1)-Fc融合蛋白(27C7),并与杜拉鲁肽进行理化性质比较。方法构建真核表达载体pCHO1.0-GLP-1-Fc,并用脂质体转染CHO细胞,经甲氨蝶呤和嘌呤霉素加压筛选,再单克隆筛选,得到1株高表达的细胞模... 目的真核表达杜拉鲁肽类似药胰高糖素样肽l(GLP-1)-Fc融合蛋白(27C7),并与杜拉鲁肽进行理化性质比较。方法构建真核表达载体pCHO1.0-GLP-1-Fc,并用脂质体转染CHO细胞,经甲氨蝶呤和嘌呤霉素加压筛选,再单克隆筛选,得到1株高表达的细胞模型。采用Protein A亲和层析法纯化目的蛋白,SDS-PAGE检测蛋白大小,质谱仪进行高分辨分子量检测,高效液相色谱法检测蛋白纯度,毛细管等点聚焦电泳(CIEF)检测蛋白等电点,细胞活性功能评价杜拉鲁肽与27C7生物活性的一致性。结果通过SDS-PAGE、样品高分辨分子量检测,27C7与杜拉鲁肽分子量一致;分子排阻色谱检测27C7与杜拉鲁肽单体纯度接近,CIEF显示27C7与杜拉鲁肽的等电点一致;体外活性检测结果表明,27C7与杜拉鲁肽的生物学活性一致。结论类似药27C7与杜拉鲁肽具有一定的一致性,可进行下一步的类似药研发工作。 展开更多

关键词 胰高血糖素样肽-1 中国仓鼠卵巢细胞 理化性质 杜拉鲁肽

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