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三种重组蛋白混合抗原的间接ELISA法检测人血清弓形虫IgM和IgG抗体 被引量：6
1
作者 丁邦胜 李霞 +2 位作者 罗庆礼 余莉 沈继龙 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2014年第4期358-363,共6页
目的比较弓形虫rSAG1、rHXGPRT和rAK三种重组蛋白作为混合抗原在弓形虫病血清免疫诊断中检测结果与进口试剂盒检测结果的差异,评价三种重组蛋白混合抗原检测在弓形虫病免疫诊断中的应用价值。方法收集经美国产Zeus Toxo-ELISA试剂盒筛... 目的比较弓形虫rSAG1、rHXGPRT和rAK三种重组蛋白作为混合抗原在弓形虫病血清免疫诊断中检测结果与进口试剂盒检测结果的差异,评价三种重组蛋白混合抗原检测在弓形虫病免疫诊断中的应用价值。方法收集经美国产Zeus Toxo-ELISA试剂盒筛选的阳性血清136例,阴性血清30例。复苏、诱导、表达含有弓形虫pET-28a/SAG1,pET-28a/HXGPRT和pET-28a/AK表达载体的3个菌株,纯化3种重组蛋白。以3种混合蛋白作为诊断抗原,采用间接ELISA法,以正交叉方法优化检测条件,检测66例弓形虫IgM阳性、70例IgG例阳性血清和30阴性血清,比较混合抗原检测和Zeus Toxo-ELISA试剂盒检测结果的差异;以Zeus Toxo-ELISA弓形虫试剂盒检测结果为标准,评价重组蛋白混合抗原检测的敏感性、特异性、总符合率以及约登指数。结果 IgM:混合抗原与Zeus Toxo-ELISA试剂检测结果经χ2检验,χ2值为3.12,P>0.05,差异无显著性。混合重组抗原的敏感性为89.4%,特异性为96.7%,总符合率为91.7%,约登指数为0.861。IgG:混合抗原与Zeus Toxo-ELISA试剂检测结果经χ2检验,χ2值为0.25,差异无显著意义(P>0.05)。采用混合重组抗原的敏感性为97.1%,特异性为93.3%,总符合率为96.0%,约登指数为0.904。结论本研究3种重组抗原(rSAG1+rHXGPRT+rAK)混合的间接ELISA法检测弓形虫IgM和IgG,与进口ELISA试剂检测的总符合率高,具有较高的敏感性、特异性;更经济。 展开更多
关键词 弓形虫 重组抗原 免疫诊断 间接ELISA
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弓形虫腺苷激酶基因的克隆、表达及多抗血清的制备 被引量：2
2
作者 李霞 余莉 +2 位作者 罗庆礼 乔增培 沈继龙 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2008年第6期495-499,共5页
目的克隆弓形虫RH株腺苷激酶(AK)基因,构建原核表达载体pET28a/AK,表达AK重组蛋白,利用此重组蛋白免疫新西兰白兔制备多抗血清。方法收集、纯化弓形虫RH株速殖子,提取总RNA。设计合成的引物并引入BamHI和XhoI酶切位点,应用RT-PCR扩增弓... 目的克隆弓形虫RH株腺苷激酶(AK)基因,构建原核表达载体pET28a/AK,表达AK重组蛋白,利用此重组蛋白免疫新西兰白兔制备多抗血清。方法收集、纯化弓形虫RH株速殖子,提取总RNA。设计合成的引物并引入BamHI和XhoI酶切位点,应用RT-PCR扩增弓形虫AK基因片段,目的基因插入克隆载体pGEM-T,提取重组质粒,BamHI和XhoI双酶切获得目的基因,插入原核表达质粒pET28a中,重组子双酶切、PCR和测序鉴定,转化大肠杆菌E.coliBL21(DE3)并以IPTG诱导表达。亲和层析法纯化重组蛋白抗原,SDS-PAGE和Western blotting验证表达量和免疫活性,免疫新西兰白兔,收集多抗血清,ELISA测定多抗滴度,Western blotting鉴定免疫活性。结果从弓形虫RH株cDNA中扩增出1 092bp的AK目标基因片段,并构建原核表达载体,诱导含pET28a/AK的宿主菌获得了高浓度、与预期分子量大小相符的表达产物,经Ni2+亲和层析法纯化获得了高纯度的rAK蛋白,Western blotting显示rAK能够被TORCH试剂盒中的Tox-IgG阳性控制血清识别,获得了纯化的重组蛋白。rAK蛋白免疫新西兰白兔,获得滴度为1∶106多价抗血清。结论成功地从弓形虫RH株基因组DNA中获取了AK基因,构建了pET28a/AK重组质粒,并获得了高效表达,免疫新西兰白兔获得了高效价多克隆抗体,为弓形虫iRNA及弓形虫病的免疫诊断奠定了基础。 展开更多
关键词 弓形虫 腺苷激酶 基因 克隆 表达 多抗血清
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金丝桃素对小鼠巨噬细胞内刚地弓形虫速殖子的增殖抑制作用 被引量：2
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作者 崔洁 王旗 +9 位作者 杨小迪 孙希萌 汪瑞 姜辉 王守祥 张敏 魏明 夏惠 陈兴智 沈继龙 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2018年第7期583-587,共5页
目的观察金丝桃素(Hypericin,Hy)对小鼠巨噬细胞内弓形虫的增殖抑制作用,为抗弓形虫天然药物的筛选提供线索。方法分离小鼠腹腔巨噬细胞(Macrophage,Mφ),建立体外Mφ感染稳定表达绿色荧光蛋白的弓形虫(RH-green fluorescent protein,RH... 目的观察金丝桃素(Hypericin,Hy)对小鼠巨噬细胞内弓形虫的增殖抑制作用,为抗弓形虫天然药物的筛选提供线索。方法分离小鼠腹腔巨噬细胞(Macrophage,Mφ),建立体外Mφ感染稳定表达绿色荧光蛋白的弓形虫(RH-green fluorescent protein,RH-GFP)速殖子模型,观察不同剂量Hy的最佳作用效果。实验分4组:(1)A组(对照组),不加Hy;(2)B组(Mφ感染RH-GFP+100μg/mL Hy);(3)C组(Mφ感染RH-GFP+200μg/mL Hy);(4)D组(Mφ感染RH-GFP+400μg/mL Hy),分别在培养1、2和3h后利用荧光显微镜和流式细胞术观察计数感染的Mφ和游离速殖子在各药物浓度及各时间点的变化;透射电镜观察虫体超微结构的变化。结果与对照组相比,随着Hy浓度的增加和用药时间的延长,Mφ内速殖子数量明显减少,游离速殖子数量也显著减少,荧光强度逐渐降低;经药物组不同浓度Hy作用后,游离/Mφ内弓形虫的比值逐渐升高,至400μg/mL剂量作用3h后开始下降,游离与胞内速殖子比例的差异在同一时间段内均有统计学意义(P<0.05),但药物作用1h或2h各实验组之间无统计学差异(P>0.05),作用3h各浓度组之间差异有统计学意义(P<0.05),各实验组同一药物浓度下在孵育1、2和3h后效果增强(P<0.05)。透射电镜观察显示,随Hy作用时间延长,虫体逐渐出现肿胀,胞膜与基质之间空隙明显,空泡形成且增多、变大,胞膜断裂,内部结构溶解溢出。结论体外实验初步显示Hy呈剂量和时间依赖性地增强对Mφ内弓形虫速殖子增殖的抑制作用,可降低宿主细胞感染率,且对胞外速殖子有一定杀伤作用。 展开更多
关键词 金丝桃素 刚地弓形虫 巨噬细胞 抑制
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