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SARS病毒刺突蛋白与TAP标签在Vero细胞内的融合表达研究 被引量：1
1
作者 郭岚 王健伟 +2 位作者 韩金祥 于修平 洪涛 《山东大学学报（医学版）》 CAS 北大核心 2005年第8期661-666,共6页
目的:探讨SARS冠状病毒(SARS-CoV)刺突蛋白(Spikeprotein,S蛋白)与钙调蛋白结合肽(calmodulinbindingpeptide,CBP)-蛋白A串连亲和纯化(tandemaffinitypurification,TAP)标签在Vero细胞内的融合表达及亚细胞定位,为其细胞结合蛋白的筛选... 目的:探讨SARS冠状病毒(SARS-CoV)刺突蛋白(Spikeprotein,S蛋白)与钙调蛋白结合肽(calmodulinbindingpeptide,CBP)-蛋白A串连亲和纯化(tandemaffinitypurification,TAP)标签在Vero细胞内的融合表达及亚细胞定位,为其细胞结合蛋白的筛选奠定基础。方法:从质粒pGEM-4Z-S中扩增S片段,在5'端加入Kozak序列,并与TAP标签基因共同插入pcDNA3.1(-)中,构建出真核表达载体pcDNA3.1-S-TAP(C)。将构建好的质粒瞬时转染Vero细胞,并共感染重组痘苗病毒vTF7-3,用间接免疫荧光及Western-blotting技术检测融合蛋白的表达及亚细胞定位。结果:成功构建出真核表达载体pcD-NA3.1-S-TAP(C),瞬时转染Vero细胞后S-CBP-蛋白A融合蛋白[S-TAP(C)]得到表达,重组痘苗病毒vTF7-3可有效增强该融合蛋白的表达水平,且检测到S-TAP(C)融合蛋白表达于细胞膜上。结论:S蛋白与TAP标签融合蛋白表达于细胞膜上,且vTF7-3的感染有助于靶蛋白表达水平的提高。 展开更多
关键词 SARS冠状病毒 刺突蛋白 TAP标签 VERO细胞 表达
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荧光定量RT-PCR在轮状病毒检测中的应用 被引量：3
2
作者 王志宇 王健伟 +3 位作者 何深一 孟红 韩金祥 洪涛 《山东大学学报（医学版）》 CAS 北大核心 2006年第3期217-221,共5页
目的:建立轮状病毒的荧光定量RT-PCR检测方法,用于检测临床腹泻样本。方法:使用Taqman探针技术,建立轮状病毒VP6特异的荧光定量RT-PCR体系。与WHO推荐的轮状病毒检测方法ELISA平行检测,对该体系的检测范围、灵敏度、特异性等参数进行评... 目的:建立轮状病毒的荧光定量RT-PCR检测方法,用于检测临床腹泻样本。方法:使用Taqman探针技术,建立轮状病毒VP6特异的荧光定量RT-PCR体系。与WHO推荐的轮状病毒检测方法ELISA平行检测,对该体系的检测范围、灵敏度、特异性等参数进行评价。并将该体系用于临床腹泻样本。结果:该荧光定量RT-PCR体系具有高度灵敏度和特异性,线性范围宽,最低可检出1TCID50/ml。对113份临床腹泻样本的平行检测结果显示,该荧光定量RT-PCR体系与ELISA的检出率差异无统计学意义(χ2=0.41,P>0.5),可同样用于临床样本检测。结论:成功建立了轮状病毒荧光定量RT-PCR体系,该体系灵敏、特异、重复性好,可用于临床检测。 展开更多
关键词 实时逆转录聚合酶链反应 轮状病毒属 聚合酶链反应
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截短型A组轮状病毒VP6在E.coli中的高效表达 被引量：1
3
作者 王志宇 王健伟 +3 位作者 何深一 吴围屏 韩金祥 洪涛 《山东大学学报（医学版）》 CAS 北大核心 2006年第5期433-437,442,共6页
目的：研究A组轮状病毒（RV）组特异性抗原（VP6）片段的表达，为RV免疫检测技术提供材料。方法：以pcDNA3．1．VP6为模板，通过PCR扩增得到VP6的截短突变体编码基因VP6．1，将其插入谷胱甘肽巯基转移酶（GST）融合表达载体pGEX-5X，在E... 目的：研究A组轮状病毒（RV）组特异性抗原（VP6）片段的表达，为RV免疫检测技术提供材料。方法：以pcDNA3．1．VP6为模板，通过PCR扩增得到VP6的截短突变体编码基因VP6．1，将其插入谷胱甘肽巯基转移酶（GST）融合表达载体pGEX-5X，在E．coli中用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（WIG）诱导表达。对表达产物进行SDS．PAGE和Western blot分析。通过改变宿主菌、培养基、IPTG浓度和培养温度等条件，提高目的蛋白的可溶性表达水平，使用GST-Sepharose 4B亲合层析进行初步纯化。结果：选定VP6氨基酸12-143片段为目的蛋白，PCR扩增其396bp的编码基因片段，构建出pGEX．5X．VP6．1。将该重组质粒转化E．coli后，SDS．PAGE和Western blotting分析均显示，含有截短VP6蛋白的重组融合蛋白GST：：VP6-1在E．coli中获得高效表达，约占菌体总蛋白的30％。该蛋白主要以包涵体形式存在，经条件优化，最终通过低浓度IPTG、低温诱导提高重组蛋白的可溶性表达水平，GST亲和层析可对其进行初步纯化。结论：VP6．1蛋白在E．coli中可被高效表达和纯化，为下一步制备抗VP6的特异性单克隆抗体并用于免疫检测打下基础。 展开更多
关键词 轮状病毒属 原核细胞 基因表达
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RNA干扰机制的研究进展 被引量：2
4
作者 宋敬东 王健伟 +2 位作者 吴围屏 韩金祥 洪涛 《生物技术通讯》 CAS 2006年第3期409-411,共3页
RNA干扰(RNAi)广泛存在于各种生物体中,是参与细胞防御与分化调控的重要机制之一。RNAi的作用由双链RNA启动,通过在转录、转录后和翻译等多个水平上对同源基因表达的特异阻断和抑制来实现,清晰地阐明其作用机制将为功能基因组学、发育... RNA干扰(RNAi)广泛存在于各种生物体中,是参与细胞防御与分化调控的重要机制之一。RNAi的作用由双链RNA启动,通过在转录、转录后和翻译等多个水平上对同源基因表达的特异阻断和抑制来实现,清晰地阐明其作用机制将为功能基因组学、发育生物学,以及抗肿瘤、抗病毒的新策略研究提供重要的理论依据。本文综述了近年来有关RNAi机制的研究进展。 展开更多
关键词 转录基因沉默 转录后基因沉默 翻译水平沉默 短干扰RNA 微小RNA
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小鼠CD4、CD8膜外区编码cDNA的克隆与表达
5
作者 王海萍 赵丽 +3 位作者 王健伟 贾友苏 韩金祥 洪涛 《安徽医科大学学报》 CAS 北大核心 2005年第1期1-4,共4页
　目的　克隆并表达小鼠CD4和CD8基因,以期制备其抗体为疫苗研究服务。方法　从小鼠脾细胞中提取总RNA,利用RT PCR技术克隆CD4、CD8α和CD8β膜外区片段的编码cDNA,利用谷光苷肽硫基转移酶 (GST)融合表达载体pGEX CS对其进行表达,利用... 　目的　克隆并表达小鼠CD4和CD8基因,以期制备其抗体为疫苗研究服务。方法　从小鼠脾细胞中提取总RNA,利用RT PCR技术克隆CD4、CD8α和CD8β膜外区片段的编码cDNA,利用谷光苷肽硫基转移酶 (GST)融合表达载体pGEX CS对其进行表达,利用聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS PAGE)和Westernblot对重组蛋白进行鉴定。结果　以小鼠脾细胞总RNA为模板,分别扩增出小鼠CD4、CD8α和CD8β膜外区片段的编码cDNA,将其插入表达载体pGEX CS,得到重组质粒pGEX CSCD4、pGEX CSCD8α和pGEX CSCD8β。将所获表达载体转化E.coliBL21,用IPTG诱导表达,SDS PAGE检测表明小鼠CD4、CD8α、CD8β片段均得到成功表达,其表达量可占菌体蛋白总量的 30%左右,且均可与抗GST抗体反应。结论　成功克隆、表达了小鼠CD4、CD8α和CD8β,为进一步制备抗体从而用于免疫学研究打下了基础。 展开更多
关键词 抗原 D4 抗原 CD8 逆转录聚合酶链反应
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