目的建立并确证一种快速、灵敏、高效的测定生物样品中SphK1活性的液质联用(LC-MS/MS)分析方法。方法采用C17-Sph作为底物,通过测定产物C17-S1P的生成量来评价SphK1的活性进行体外酶促反应。终止反应后,生物样品经液-液萃取,真空干燥,复...目的建立并确证一种快速、灵敏、高效的测定生物样品中SphK1活性的液质联用(LC-MS/MS)分析方法。方法采用C17-Sph作为底物,通过测定产物C17-S1P的生成量来评价SphK1的活性进行体外酶促反应。终止反应后,生物样品经液-液萃取,真空干燥,复溶,进行LC-MS/MS分析。通过测定产物C17-S1P的生成量来评价SphK1的活性。结果 C17-S1P标准曲线的线性范围为10～1 000 ng mL-1,相关系数r2>0.998,最低检测限(LLOQ)为10 ng mL-1。HEK293细胞转染了野生型SphK(SphKWT)后,SphK1活性显著增加。相反HEK293细胞转染了突变型SphK(SphKG82D)后,SphK1活性接近正常水平。结论该方法能够灵敏快速地测量SphK1活性,为研究SphK1信号通路及其相应靶标药物提供了有效的分析手段。展开更多
文摘目的建立并确证一种快速、灵敏、高效的测定生物样品中SphK1活性的液质联用(LC-MS/MS)分析方法。方法采用C17-Sph作为底物,通过测定产物C17-S1P的生成量来评价SphK1的活性进行体外酶促反应。终止反应后,生物样品经液-液萃取,真空干燥,复溶,进行LC-MS/MS分析。通过测定产物C17-S1P的生成量来评价SphK1的活性。结果 C17-S1P标准曲线的线性范围为10～1 000 ng mL-1,相关系数r2>0.998,最低检测限(LLOQ)为10 ng mL-1。HEK293细胞转染了野生型SphK(SphKWT)后,SphK1活性显著增加。相反HEK293细胞转染了突变型SphK(SphKG82D)后,SphK1活性接近正常水平。结论该方法能够灵敏快速地测量SphK1活性,为研究SphK1信号通路及其相应靶标药物提供了有效的分析手段。
