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细胞外调节蛋白激酶信号通路参与机械牵张诱导肺泡上皮细胞高迁移率族蛋白B1的表达调控 被引量：3
1
作者 丁宁 肖慧 +2 位作者 高巨 许立新 佘守章 《解剖学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第6期919-922,共4页
目的探讨细胞外调节蛋白激酶(ERK)信号通路在机械牵张诱导肺泡上皮细胞(A549)表达高迁移率族蛋白B1(HMGB1)中的作用。方法肺泡上皮细胞A549分为A、B、C3组,A组为对照组;B组A549细胞施加14%牵张应变,牵张时间为4h;C组细胞的牵张模式与B... 目的探讨细胞外调节蛋白激酶(ERK)信号通路在机械牵张诱导肺泡上皮细胞(A549)表达高迁移率族蛋白B1(HMGB1)中的作用。方法肺泡上皮细胞A549分为A、B、C3组,A组为对照组;B组A549细胞施加14%牵张应变,牵张时间为4h;C组细胞的牵张模式与B组相同,只是于施加牵张前用ERK的特异性抑制剂PD98059预处理A549细胞2h。分别用免疫细胞化学染色和RT-PCR检测细胞HMGB1蛋白和mRNA的表达,用Westernblotting检测ERK激酶的活性。结果A549细胞施加14%牵张应变后,HMGB1蛋白和mRNA表达明显增加,ERK激酶活性明显增高(P<0.05);该诱导激活作用可被PD98059阻断。结论机械牵张通过ERK信号通路,调节A549细胞的HMGB1基因和蛋白表达。 展开更多
关键词 机械牵张 高迁移率族蛋白B1 细胞外调节蛋白激酶 免疫组织化学 反转录.聚合酶链反应 免疫 印迹法 肺泡上皮细胞
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应用噬菌体展示技术筛选HMGB1启动子结合蛋白 被引量：5
2
作者 丁宁 肖慧 +2 位作者 高巨 许立新 佘守章 《中国病理生理杂志》 CAS CSCD 北大核心 2010年第1期28-31,共4页
目的:筛选高迁移率族蛋白B1(HMGB1)启动子结合蛋白。方法:应用噬菌体展示技术,以HMGB1启动子DNA作为固相筛选分子,对噬菌体展示环七肽库进行4轮"吸附-洗脱-扩增"生物筛选,从第4轮洗脱物中随机挑选20个单克隆噬菌体扩增后进行E... 目的:筛选高迁移率族蛋白B1(HMGB1)启动子结合蛋白。方法:应用噬菌体展示技术,以HMGB1启动子DNA作为固相筛选分子,对噬菌体展示环七肽库进行4轮"吸附-洗脱-扩增"生物筛选,从第4轮洗脱物中随机挑选20个单克隆噬菌体扩增后进行ELISA鉴定。对所筛选克隆进行DNA序列测定和生物信息学分析。结果:经过4轮筛选后,对随机选取的20个噬菌体克隆进行鉴定,其中11个可与HMGB1启动子结合。DNA测序后经过同源性搜索,确定了与HMGB1启动子具有结合作用的蛋白,包括激活蛋白-1(activator protein-1,AP-1)等6种已知功能蛋白和2种未知功能蛋白。结论:筛选到HMGB1启动子的结合蛋白,为研究HMGB1基因的转录调控机制奠定基础。 展开更多
关键词 高迁移率族蛋白1 启动子 噬菌体展示 肽库 基因表达调控
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p38MAPK在周期性机械牵张诱导肺泡巨噬细胞表达HMGB1中的作用 被引量：5
3
作者 丁宁 肖慧 +2 位作者 高巨 许立新 佘守章 《中国病理生理杂志》 CAS CSCD 北大核心 2009年第10期1979-1982,共4页
目的:研究p38 MAPK在周期性机械牵张诱导肺泡巨噬细胞(AM)表达高迁移率族蛋白B1(HMGB1)中的作用。方法:大鼠AM随机分为A、B、C3组,A组为对照组;B组细胞施加20%牵张应变,牵张时间为4h;C组细胞的牵张模式与B组相同,在牵张前用p38 MAPK特... 目的:研究p38 MAPK在周期性机械牵张诱导肺泡巨噬细胞(AM)表达高迁移率族蛋白B1(HMGB1)中的作用。方法:大鼠AM随机分为A、B、C3组,A组为对照组;B组细胞施加20%牵张应变,牵张时间为4h;C组细胞的牵张模式与B组相同,在牵张前用p38 MAPK特异性抑制剂SB203580(40μmol/L)预处理2h。利用RT-PCR法检测HMGB1 mRNA的表达,Western blotting检测HMGB1蛋白表达和p38 MAPK的活性。结果:与对照组相比,AM施加20%牵张应变可诱导HMGB1蛋白和mRNA表达明显增加、p38 MAPK活性明显增高(均P<0.05),SB203580可显著抑制牵张应变的这种诱导作用(均P<0.05)。结论:周期性机械牵张可能通过p38 MAPK信号通路,调节肺泡巨噬细胞HMGB1 mRNA和蛋白的表达。 展开更多
关键词 机械牵张 高迁移率族蛋白质1 P38MAP激酶 肺泡巨噬细胞
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机械牵张诱导THP-1细胞高迁移率族蛋白B1移位出核 被引量：1
4
作者 丁宁 肖慧 +1 位作者 许立新 佘守章 《中国病理生理杂志》 CAS CSCD 北大核心 2011年第2期382-385,共4页
目的:探讨机械牵张对高迁移率族蛋白B1(HMGB1)在THP-1细胞内移位的影响。方法:构建HMGB1-增强型绿色荧光蛋白(EGFP)融合蛋白的真核表达载体。通过两步亚克隆的方法,将HMGB1和EGFP的编码序列以融合蛋白的形式克隆到pcDNA3-HA载体上,随后... 目的:探讨机械牵张对高迁移率族蛋白B1(HMGB1)在THP-1细胞内移位的影响。方法:构建HMGB1-增强型绿色荧光蛋白(EGFP)融合蛋白的真核表达载体。通过两步亚克隆的方法,将HMGB1和EGFP的编码序列以融合蛋白的形式克隆到pcDNA3-HA载体上,随后转染THP-1细胞并施加机械牵张应变,荧光显微镜观察HMGB1在细胞内的表达及移位情况。结果:重组质粒经酶切鉴定证明构建正确,并在THP-1细胞中大量表达。荧光显微镜观察发现,HMGB1-EGFP融合蛋白主要分布于细胞核,经机械牵张18 h,可见细胞中融合蛋白从细胞核移位到细胞质,在细胞浆中观察到明显的绿色荧光。结论:成功构建了HMGB1-EGFP融合蛋白,在THP-1细胞中观察到机械牵张可诱导HMGB1移位出核。 展开更多
关键词 机械牵张 高迁移率族蛋白质类 THP-1细胞
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HMGB1启动子红色荧光蛋白报告基因载体的构建及在机械牵张诱导下的活性检测
5
作者 丁宁 肖慧 +2 位作者 高巨 许立新 佘守章 《第三军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第22期2237-2239,共3页
目的构建高迁移率族蛋白B1(high mobility group box 1 protein,HMGB1)启动子的红色荧光蛋白报告基因载体。方法采用基因重组技术构建含HMGB1启动子区的红色荧光蛋白报告基因载体pDsRed1-1-HMGB1P。经PCR、酶切和DNA测序鉴定后,将重组... 目的构建高迁移率族蛋白B1(high mobility group box 1 protein,HMGB1)启动子的红色荧光蛋白报告基因载体。方法采用基因重组技术构建含HMGB1启动子区的红色荧光蛋白报告基因载体pDsRed1-1-HMGB1P。经PCR、酶切和DNA测序鉴定后,将重组载体转染HEK293细胞,在荧光显微镜下观察其在细胞内的表达以及对机械牵张刺激的反应。以转染空载体pDsRed1-1的细胞作为对照。结果PCR、酶切和DNA测序表明重组载体pDsRed1-1-HMGB1P的构建正确,该表达载体在HEK293细胞静息状态下表达水平较低,经机械牵张刺激后,在荧光显微镜下可看到高亮度的红色荧光。转染空载体pDsRed1-1的细胞未见红色荧光。结论成功构建了HMGB1启动子的红色荧光蛋白报告基因载体,对机械牵张刺激有很好的反应。 展开更多
关键词 高迁移率族蛋白B1 红色荧光蛋白 基因 报告 机械牵张
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利用生物素-链亲和素系统筛选呼吸机所致肺损伤HMGB1启动子结合蛋白
6
作者 丁宁 肖慧 +1 位作者 许立新 佘守章 《第四军医大学学报》 北大核心 2009年第21期2345-2347,共3页
目的:筛选呼吸机所致肺损伤(VILI)高迁移率族蛋白B1(HMGB1)的启动子结合蛋白.方法:制备VILI大鼠模型,与正常对照组大鼠同期处死,取肺组织提取细胞核蛋白.用PCR法扩增末端带生物素标记的HMGB1启动子探针,将细胞核蛋白与制备的HMGB1启动... 目的:筛选呼吸机所致肺损伤(VILI)高迁移率族蛋白B1(HMGB1)的启动子结合蛋白.方法:制备VILI大鼠模型,与正常对照组大鼠同期处死,取肺组织提取细胞核蛋白.用PCR法扩增末端带生物素标记的HMGB1启动子探针,将细胞核蛋白与制备的HMGB1启动子探针进行孵育,再以标记有链亲和素的磁珠分离HMGB1启动子-蛋白反应复合物,分别用0.25mol/L和1mol/LNaCl洗脱探针上结合的蛋白,SDS-PAGE电泳分离样品蛋白,并对凝胶进行银染显色,比较VILI组与正常对照组的差异条带.结果:两组细胞核蛋白中共观察到24条差异条带.分析差异条带显示,与正常对照组比较,在低亲和力作用水平,机械通气后有6个蛋白与HMGB1启动子的结合力增强,有2个蛋白的结合力减弱;在高亲和力作用水平,有10个蛋白与HMGB1启动子的结合力增强,有6个蛋白的结合力减弱.结论:筛选到一些VILI特异性HMGB1启动子结合蛋白,对于研究HMGB1的转录调控机制具有重要意义. 展开更多
关键词 高迁移率族蛋白B1 机械通气 急性肺损伤 启动子 生物素-链亲和素
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MKK6p38α信号通路在机械牵张诱导肺泡上皮细胞表达晚期糖基化终末产物受体中的作用 被引量：4
7
作者 丁宁 肖慧 +1 位作者 许立新 余守章 《中国危重病急救医学》 CAS CSCD 北大核心 2009年第10期597-600,共4页
目的探讨p38α及其上游激酶丝裂素活化蛋白激酶6（MKK6）在机械牵张诱导肺泡上皮细胞（A549）表达晚期糖基化终末产物受体（RAGE）中的作用。方法应用阳离子脂质体DOTAP介导的基因转染方法将p38a显性无活性突变体p38α（AF）＋绿色荧光... 目的探讨p38α及其上游激酶丝裂素活化蛋白激酶6（MKK6）在机械牵张诱导肺泡上皮细胞（A549）表达晚期糖基化终末产物受体（RAGE）中的作用。方法应用阳离子脂质体DOTAP介导的基因转染方法将p38a显性无活性突变体p38α（AF）＋绿色荧光表达载体pGFP及MKK6b的组成性活性突变体MKK6b（E）＋pGFP分别导入A549细胞，以质粒pcDNA3＋pGFP作为阴性对照。以pGFP作为空白对照。应用蛋白质免疫印迹法（Westernblotting）检测转染基因。建立体外细胞牵张应变模型，观察各组细胞在施加20％牵张应变时p38激酶活性变化及RAGE的蛋白和mRNA表达变化。结果Western blotting检测结果显示，外源基因成功转染A549细胞，并在细胞内表达。在A549细胞牵张应变模型中观察到，MKK6b（E）转染细胞内p38激酶活性明显升高，而p38a（AF）转染细胞内p38激酶活性显著下降；MKK6b（E）基因转染可促进20％牵张应变诱导A549细胞RAGE的蛋白和mRNA表达，而p38α（AF）基因转染则抑制牵引应变诱导的RAGE蛋白和mRNA表达。结论牵张应变通过MKK6p38α信号通路调节A549细胞RAGE的表达。 展开更多
关键词 机械牵张 肺泡上皮细胞 P38丝裂素活化蛋白激酶 晚期糖基化终末产物受体
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