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马山黑山羊MAPK8基因克隆、生物信息学分析及真核表达载体构建
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作者 雷志刚 潘宏 +4 位作者 张丹丹 刘权辉 孙哲 邓珊 黄奔 《中国畜牧兽医》 北大核心 2025年第2期534-544,共11页
[目的]克隆马山黑山羊丝裂原活化蛋白激酶8(mitogen-activated protein kinase 8,MAPK8)基因序列,并对该基因进行生物信息学分析,构建其真核表达载体,为山羊乳腺发育及MAPK8基因在转分化过程中的研究提供试验材料。[方法]参考山羊MAPK8... [目的]克隆马山黑山羊丝裂原活化蛋白激酶8(mitogen-activated protein kinase 8,MAPK8)基因序列,并对该基因进行生物信息学分析,构建其真核表达载体,为山羊乳腺发育及MAPK8基因在转分化过程中的研究提供试验材料。[方法]参考山羊MAPK8基因序列(GenBank登录号:XM_018042429.1)设计引物,利用PCR扩增马山黑山羊MAPK8基因CDS序列并克隆;分别使用DNAStar和Mega 11.0软件进行序列比对及系统进化树构建,并利用ProtParam、ProtScale等软件进行生物信息学分析;构建真核表达载体并进行慢病毒包装后收集病毒液上清,感染马山黑山羊成纤维细胞,并通过实时荧光定量PCR检测感染病毒组和对照组MAPK8基因表达水平。[结果]马山黑山羊MAPK8基因CDS区全长1 155 bp,编码384个氨基酸,蛋白分子质量为43.98 ku,分子式为C_(1968)H_(3114)N_(528)O_(569)S_(22),等电点(pI)为7.13。相似性比对结果显示,马山黑山羊与不同物种间MAPK8基因氨基酸序列相似性均高于85%,表明MAPK8氨基酸序列较为保守。系统进化树显示,马山黑山羊MAPK8基因氨基酸序列与牛的亲缘关系最近,与斑马鱼的亲缘关系最远。马山黑山羊MAPK8蛋白为亲水性,不属于跨膜蛋白,主要分布在细胞质(52.2%)、线粒体(26.1%)、细胞核(17.4%)和细胞膜(4.3%)中,含有丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶催化结构域(第26―321位氨基酸处)。MAPK8蛋白二级结构包括无规则卷曲、α-螺旋、β-转角和延伸链。互作蛋白预测显示,MAPK8蛋白可能与MAPK9、JUN、TP53、FOS、JUNB、MAP2K4、MAP2K7、MAPK8IP1和NFATC3蛋白存在互作。试验成功构建MAPK8基因慢病毒真核表达载体pCDH-CMV-MAPK8-mchery-Puro,转染马山黑山羊成纤维细胞后产生红色荧光信号,试验组细胞内MAPK8基因表达量极显著高于对照组(P<0.01)。[结论]本研究成功克隆了马山黑山羊MAPK8基因CDS序列,并构建了pCDH-CMV-MAPK8-mchery-Puro真核表达载体,为山羊MAPK8基因功能及应用研究提供了基础数据。 展开更多
关键词 马山黑山羊 MAPK8基因 生物信息学 真核表达
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