MEKK3是丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)家族的重要成员,主要参与激活c-Jun氨基末端激酶(c-Jun NH2-terminal kinases,JNK)和细胞外调节(extracellular regulated protein kinases,ERK)两条通路。利用生物...MEKK3是丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)家族的重要成员,主要参与激活c-Jun氨基末端激酶(c-Jun NH2-terminal kinases,JNK)和细胞外调节(extracellular regulated protein kinases,ERK)两条通路。利用生物信息学分析野生型MEKK3(MEKK3WT)及突变型MEKK3(MEKK3K391M)蛋白的理化性质、亲/疏水性、跨膜区、二/三级结构、相互作用蛋白等。结果表明,MEKK3K391M蛋白的稳定性增强,亲/疏水性最强位点未改变,α-螺旋、β-折叠及蛋白结合位点与MEKK3WT不同。三级结构分析显示,MEKK3K391M空间位阻增大。据GenBank提供的人源MEKK3的cDNA序列(NM_203351),扩增出野生型MEKK3WT目的基因,用重叠延伸PCR定点突变技术扩增突变型MEKK3K391M目的基因,并将其克隆至带有FLAG标签的真核表达载体pCMV-tag-2c中。DNA序列分析结果表明,MEKK3K391M基因序列成功将编码赖氨酸(Lys,K)的密码子AAG突变为编码甲硫氨酸(Met,M)的密码子ATG;免疫印迹分析显示,MEKK3WT、MEKK3K391M重组体均在PC12细胞中高效表达;MEKK3WT可以激活JNK,使JNK发生磷酸化反应,其条带灰度值明显高于对照组和MEKK3K391M组。MEKK3K391M组的P-JNK与对照组相差不大。总之,MEKK3中K391的氨基酸突变引起了蛋白结构和功能的改变,特别是三级结构的空间位阻加大,使MEKK3K391M与ATP结合能力减弱,从而无法呈递磷酸基团催化相应的底物,失去生物学活性。本研究对寻找神经系统疾病JNK通路中与MEKK3相互作用的蛋白分子、探索蛋白相互作用机制提供实验基础。展开更多
文摘MEKK3是丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)家族的重要成员,主要参与激活c-Jun氨基末端激酶(c-Jun NH2-terminal kinases,JNK)和细胞外调节(extracellular regulated protein kinases,ERK)两条通路。利用生物信息学分析野生型MEKK3(MEKK3WT)及突变型MEKK3(MEKK3K391M)蛋白的理化性质、亲/疏水性、跨膜区、二/三级结构、相互作用蛋白等。结果表明,MEKK3K391M蛋白的稳定性增强,亲/疏水性最强位点未改变,α-螺旋、β-折叠及蛋白结合位点与MEKK3WT不同。三级结构分析显示,MEKK3K391M空间位阻增大。据GenBank提供的人源MEKK3的cDNA序列(NM_203351),扩增出野生型MEKK3WT目的基因,用重叠延伸PCR定点突变技术扩增突变型MEKK3K391M目的基因,并将其克隆至带有FLAG标签的真核表达载体pCMV-tag-2c中。DNA序列分析结果表明,MEKK3K391M基因序列成功将编码赖氨酸(Lys,K)的密码子AAG突变为编码甲硫氨酸(Met,M)的密码子ATG;免疫印迹分析显示,MEKK3WT、MEKK3K391M重组体均在PC12细胞中高效表达;MEKK3WT可以激活JNK,使JNK发生磷酸化反应,其条带灰度值明显高于对照组和MEKK3K391M组。MEKK3K391M组的P-JNK与对照组相差不大。总之,MEKK3中K391的氨基酸突变引起了蛋白结构和功能的改变,特别是三级结构的空间位阻加大,使MEKK3K391M与ATP结合能力减弱,从而无法呈递磷酸基团催化相应的底物,失去生物学活性。本研究对寻找神经系统疾病JNK通路中与MEKK3相互作用的蛋白分子、探索蛋白相互作用机制提供实验基础。
