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题名人源NOVA1蛋白的真核表达及其抗低氧活性鉴定
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作者
李华玲
吕贝
孔玲
陈欣虹
朱素娟
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机构
扬州大学医学院生物化学教研室
扬州大学生技学院生物化学教研室
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出处
《生物工程学报》
CAS
CSCD
北大核心
2016年第4期507-517,共11页
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基金
国家自然科学基金(Nos.81100862
8167050872
2015CXJ070)资助~~
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文摘
构建人NOVA1基因的真核表达载体pCMV-Myc-NOVA1,转染PC12细胞后筛选最佳转染条件,进而结合细胞免疫组织化学研究NOVA1蛋白在PC12细胞中的表达分布,并探究其抗低氧活性。根据NCBI数据库NOVA1基因序列设计上下游引物,以pCR4-TOPO-NOVA1载体为模板采用聚合酶链式反应扩增获得NOVA1基因的全长c DNA编码序列,限制性内切酶SalⅠ和XhoⅠ双酶切后插入pCMV-Myc真核表达载体,酶切及直接测序验证后采用脂质体转染法转染入PC12细胞,针对转染比例和转染时间进行优化,进而采用实时定量PCR和Western blotting检测NOVA1蛋白的表达,最后采用细胞免疫组织化学检测NOVA1蛋白在PC12细胞中的表达定位及其抗低氧活性。通过酶切和直接测序验证,成功构建了真核表达载体pCMV-Myc-NOVA1;质粒和Lipo2000最佳转染比例为1:2.5,最佳转染时间为72 h;最佳转染条件下NOVA1基因和蛋白的表达水平显著增加,转染pCMV-Myc-NOVA1质粒后,NOVA1蛋白主要分布于细胞核和细胞质;过表达NOVA1的PC12细胞增殖活性明显增加。本文采用分子克隆的方法成功构建了NOVA1基因的真核表达载体,通过条件优化实现了高效表达并测定过表达NOVA1蛋白具有明显的抗低氧活性,不仅为深入揭示NOVA1蛋白的作用机理提供了重要参考,而且为NOVA1蛋白潜在的药物开发提供了重要技术支撑。
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关键词
人源NOVA1蛋白
真核表达载体
转染
分布
抗低氧
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Keywords
human NOVA1 protein
eukaryotic expression vector
transfection
distribution
anti-hypoxia
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分类号
Q78
[生物学—分子生物学]
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