仔猪腹泻病流行现状及防控技术研究进展 被引量：1

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作者 刘诗雨 李彬 《广东畜牧兽医科技》 2023年第3期1-7,共7页

仔猪腹泻病在猪群中发病急、规模大、速度快,年平均发病率高,给全球养猪业带来巨大威胁,导致惨重的经济损失。仔猪腹泻病病因复杂,引起仔猪腹泻的主要病原具有能自然重组、持续变异、宿主谱广和血清型多样等流行特征。随着变异病原增多... 仔猪腹泻病在猪群中发病急、规模大、速度快,年平均发病率高,给全球养猪业带来巨大威胁,导致惨重的经济损失。仔猪腹泻病病因复杂,引起仔猪腹泻的主要病原具有能自然重组、持续变异、宿主谱广和血清型多样等流行特征。随着变异病原增多、混合感染情况严重及疫苗保护效果下降等问题的出现,迫切需要开发更灵敏准确的检测手段、更安全有效的可用疫苗和升级现有的综合防控技术。该文就仔猪腹泻病的病因、流行现状和综合防控关键技术研究进展方面进行阐述总结,提出疫病精准诊断、疫苗合理选择、加强生物安全和严格饲养管理等的综合防控措施,为诊断和防控该病提供参考依据。 展开更多

关键词 仔猪腹泻病 病毒性腹泻 流行现状 疫苗 综合防控

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不同基因型牛病毒性腹泻病毒对BALB/c小鼠致病性研究

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作者 刘镝钺 程子龙 +8 位作者 陈益 陈思宇 李文良 毛立 杨蕾蕾 孙敏 张纹纹 熊富强 刘茂军 《畜牧与兽医》 CAS 2024年第4期72-77,共6页

牛病毒性腹泻病毒(BVDV)是危害养牛业的重要病原。2021年本实验室从患有肺炎的牛肺中分离出1株BVDV(毒株编号为JS2201),经鉴定为1b亚型。为了评价该分离株的毒力与致病性,分别建立了分离株与参考株BVDV-1型Oregon C24V株、BVDV-2型C1602... 牛病毒性腹泻病毒(BVDV)是危害养牛业的重要病原。2021年本实验室从患有肺炎的牛肺中分离出1株BVDV(毒株编号为JS2201),经鉴定为1b亚型。为了评价该分离株的毒力与致病性,分别建立了分离株与参考株BVDV-1型Oregon C24V株、BVDV-2型C1602株BVDV感染BALB/c小鼠模型,通过检测攻毒后小鼠临床症状、体重变化、病毒血症情况、血液中白细胞与淋巴细胞的变化、组织器官的病理组织学变化及病毒载量,比较了分离株JS2201与1型和2型参考株的致病性差异。结果显示:BVDV分离株JS2201与参考株均能够成功感染BALB/c小鼠,攻毒BALB/c小鼠均形成病毒血症,导致血液中白细胞数量、淋巴细胞数量以及淋巴细胞百分比短暂下降;BVDV分离株JS2201株攻毒组小鼠肝脏、肾脏、肺脏、脾脏中BVDV载量要高于C24V、C1602株攻毒组;攻毒组小鼠均表现为间质性肺炎病变,JS2201株攻毒组与1型参考株C24V株攻毒组小鼠肺脏病理组织学变化相似,BVDV-2型参考株C1602株攻毒组小鼠肺脏病变更为严重。综上,本研究成功建立了不同亚型BVDV急性感染BALB/c小鼠的模型,且比较分析了分离株与参考株之间的致病性差异,为BVDV疫苗的研制以及致病机制的研究奠定了基础。 展开更多

关键词 牛病毒性腹泻病毒 BALB/C小鼠 致病性 基因型

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猪肺炎支原体通过抑制SPLUNC1功能破坏呼吸道炎性反应平衡

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作者 王海燕 张珍珍 +2 位作者 倪博 刘蓓蓓 冯志新 《中国农业科学》 CAS CSCD 2024年第1期216-226,共11页

【背景】猪肺炎支原体(Mycoplasmahyopneumoniae,Mhp)通过定植猪呼吸道黏膜层,破坏呼吸道炎性反应平衡,引起炎性损伤和持续性感染。短的上腭、肺及鼻咽上皮克隆1蛋白(short palate lung and nasal epithelial clone1,SPLUNC1)是呼吸道... 【背景】猪肺炎支原体(Mycoplasmahyopneumoniae,Mhp)通过定植猪呼吸道黏膜层,破坏呼吸道炎性反应平衡,引起炎性损伤和持续性感染。短的上腭、肺及鼻咽上皮克隆1蛋白(short palate lung and nasal epithelial clone1,SPLUNC1)是呼吸道黏膜分泌的具有重要抗菌和抗炎功能的蛋白,被认为是呼吸道黏膜面对危险信号时的“信号传感器”。【目的】从Mhp和SPLUNC1相互作用入手,分析Mhp感染对SPLUNC1表达的影响以及SPLUNC1对Mhp引起的炎性反应的调控作用,揭示Mhp引起炎性损伤的新机制,为解决Mhp持续性感染问题提供参考。【方法】利用猪肺炎支原体对猪支气管上皮细胞(porcine bronchial epithelial cells,PBECs)感染模型和猪体感染模型,通过荧光定量PCR、间接免疫荧光和Western-blotting等方法,分别检测Mhp感染后对肺脏中SPLUNC1以及体外PBECs中SPLUNC1转录和表达的影响。克隆并扩增猪源SPLUNC1基因通过酶切鉴定,构建成功SPLUNC1真核和原核表达重组质粒pCDNA3.1-SPLUNC1以及pET28a-SPLUNC1。与此同时,设计靶向SPLUNC1的siRNA干扰片段。利用体外SPLUNC1蛋白孵育、体内呼吸道黏膜SPLUNC1抗体封闭,通过Mhp CCU50检测明确SPLUNC1对Mhp体内外生长的影响。在猪支气管上皮细胞中,通过过表达或siRNA干扰SPLUNC1基因,后感染Mhp,利用Western-blotting、间接免疫荧光以及酶联免疫吸附方法,明确SPLUNC1对Mhp的黏附作用、诱导炎性因子表达以及MAPK信号通路活化的影响。【结果】Mhp感染猪后可引起肺脏实变,主要组织病理表现为肺脏炎性损伤,同时显著上调肺泡灌洗液中趋化因子CXCL8和炎性因子TNFα和IL-1β分泌。Mhp体内外感染后,体内肺脏和体外猪支气管上皮细胞中SPLUNC1的转录和表达均显著下调。以上研究表明,Mhp可诱导肺脏炎性反应,抑制SPLUNC1表达。另一方面,体外PBECs中过表达SPLUNC1后,Mhp感染引起的CXCL8表达显著减少;siRNA干扰SPLUNC1后,Mhp感染引起的CXCL8表达显著增加,表明SPLUNC1负调控Mhp感染引起的CXCL8表达。基于Mhp感染入侵呼吸道过程,本研究进一步解析SPLUNC1负调控CXCL8表达的机制。结果表明:无论是SPLUNC1和Mhp体外孵育,还是SPLUNC1抗体体内封闭,Mhp的体内外生长均未受影响;SPLUNC1的过表达或siRNA干扰对Mhp体外黏附PBECs的能力也无显著影响;过表达SPLUNC1可抑制pERK和IκBα的激活,相反SPLUNC1 siRNA干扰后,可促进pERK和IκBα的激活。以上研究证明SPLUNC1不是通过调控Mhp的生长和黏附,而是通过负调控MAPK-ERK通路的活化来调控CXCL8的表达。【结论】SPLUNC1可通过MAPK-ERK信号通路来调控炎性因子的过度表达,维护宿主炎性平衡;与此同时,Mhp感染后可通过抑制SPLUNC1的表达来破坏宿主炎性反应的平衡调控,进而引起炎性损伤。本研究为解析Mhp感染损伤机制提供依据。 展开更多

关键词 猪肺炎支原体 支原体-宿主相互作用 炎性反应 SPLUNC1

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猪圆环病毒2型ORF1部分位点突变对病毒复制能力的影响 被引量：1

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作者 李荷然 肖琦 +3 位作者 温立斌 朱雪蛟 芮荣 何孔旺 《畜牧与兽医》 CAS 2024年第1期71-76,共6页

猪圆环病毒2型(PCV2)可引起断奶仔猪多系统衰竭综合征,导致仔猪逐渐消瘦。PCV2 ORF1表达的Rep蛋白及其剪切体Rep′是PCV2复制所需的重要蛋白。为了研究PCV2 ORF1部分位点对PCV2复制能力的影响,本试验通过构建PCV2 ORF1区域点突变双拷贝... 猪圆环病毒2型(PCV2)可引起断奶仔猪多系统衰竭综合征,导致仔猪逐渐消瘦。PCV2 ORF1表达的Rep蛋白及其剪切体Rep′是PCV2复制所需的重要蛋白。为了研究PCV2 ORF1部分位点对PCV2复制能力的影响,本试验通过构建PCV2 ORF1区域点突变双拷贝感染性克隆质粒,在无PCV2污染的PK-15细胞中进行病毒拯救,使用荧光定量PCR检测不同位点突变病毒培养不同代次上清液的Ct值。结果:将PCV2 Rep的17 aa、19 aa、20 aa和21 aa突变为丙氨酸后病毒无法成功拯救,2 aa突变后严重影响病毒的复制能力,3 aa、5 aa和18 aa突变后病毒的复制能力增强且细胞病毒载量高于PCV2原毒株,推测17 aa、19 aa、20 aa和21 aa是影响PCV2复制的关键作用位点。本研究结果为未来PCV2复制相关研究提供了试验依据。 展开更多

关键词 猪圆环病毒2型 REP蛋白 病毒复制

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猪肺炎支原体人工感染引起易感猪各肺叶病变差异的研究 被引量：5

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作者 甘源 谢星 +13 位作者 张磊 熊祺琰 杨浩 刘蓓蓓 韦艳娜 王海燕 于岩飞 白昀 袁厅 李俊 郝飞 华利忠 邵国青 冯志新 《扬州大学学报（农业与生命科学版）》 CAS 北大核心 2020年第4期71-76,共6页

为研究猪肺炎支原体对易感猪肺脏及各肺叶部位的损伤差异性,选二元猪(大白×二花脸)和三元猪(杜洛克×长白×大白) 2个品系,共6批次的猪肺炎支原体(Mhp)阴性猪,经人工"气管定位注射"途径感染猪肺炎支原体,于感染... 为研究猪肺炎支原体对易感猪肺脏及各肺叶部位的损伤差异性,选二元猪(大白×二花脸)和三元猪(杜洛克×长白×大白) 2个品系,共6批次的猪肺炎支原体(Mhp)阴性猪,经人工"气管定位注射"途径感染猪肺炎支原体,于感染后28 d剖检,通过肉眼观察,运用"猪支原体肺炎的肺病变28分制评分法"对肺脏及各个肺叶部位所显示的病变情况进行测算、评分、统计和分析,并对所收集的肺泡灌洗液(BAFL)中猪肺炎支原体病原进行PCR检测。结果表明:猪肺炎支原体能引起肺脏各个肺叶产生特异性"虾肉样"病变,该病变主要呈现在心叶和尖叶部位。不同肺叶所呈现的病变程度存在一定的差异,其中猪肺炎支原体对心叶造成病变最严重,且右心叶比左心叶严重。猪肺炎支原体引起的右肺的病变程度高于左肺,推测其在右肺部位的定植水平可能高于左肺。通过猪肺炎支原体人工感染引起易感猪各肺叶病变差异的研究,为丰富猪支原体肺炎的临床诊断方法和致病机制、疫苗免疫效果评价研究提供了参考依据。 展开更多

关键词 猪肺炎支原体 易感猪 气管注射 肺病变

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后非瘟时代猪场PRRSV类NADC30感染防控案例分析

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作者 张磊 华利忠 +4 位作者 郝飞 刘蓓蓓 孙叶茂 冯志新 邵国青 《江苏农业科学》 北大核心 2023年第21期182-187,共6页

猪繁殖与呼吸综合征一直是影响养猪业最严重的疾病,通过对1个PRRSV阴性猪场母猪突发大量流产的病例进行抗体和病原检测,细菌分离鉴定和MIC测定,然后制定和实施防控措施和评价指标。结果发现:(1)50份流产母猪PRRSV抗体检测阳性率100%;(2... 猪繁殖与呼吸综合征一直是影响养猪业最严重的疾病,通过对1个PRRSV阴性猪场母猪突发大量流产的病例进行抗体和病原检测,细菌分离鉴定和MIC测定,然后制定和实施防控措施和评价指标。结果发现:(1)50份流产母猪PRRSV抗体检测阳性率100%;(2)母猪血清、流产物、睾丸去势液及保育猪组织样本,PRRSV阳性率分别为90.0%、80.0%、100.0%及85.7%,但所有样本CSFV、PRV、PPV及SIV病原均为阴性;(3)4份PRRSV阳性样本经ORF3、ORF5及Nsp2测序和比对,结果均与NADC30同源性最高;(4)保育猪组织样本分离到链球菌和副猪嗜血杆菌,MIC测定结果显示氟苯尼考和阿莫西林对上述2种分离菌最敏感;(5)控制措施实施后的3个月,母猪的流产率从发病期的43.6%,下降至3.6%,断奶7 d内配种率从发病期的63.3%上升至87.5%,哺乳仔猪和保育猪的死亡率分别从发病期的28.4%和38.8%下降至3.8%和4.7%。通过对该病例的诊断和疫情分析,采用灭活苗免疫接种和药物保健综合防控措施可快速取得效果,为规模化种猪场的PRRSV暴发防控提供参考。 展开更多

关键词 猪繁殖与呼吸综合征 病原检测 最小抑菌浓度 防控 评价

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羊腹泻样本中大肠杆菌的分离、毒力基因与耐药性分析

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作者 刘鑫欢 恽佳蕾 +11 位作者 毛立 李基棕 郝飞 何苗锋 杨蕾蕾 张纹纹 程子龙 孙敏 刘茂军 王少辉 白娟 李文良 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2023年第8期3445-3454,共10页

为确定华东地区发生腹泻的羊群中大肠杆菌感染、毒力基因携带及耐药性情况,本研究通过分离鉴定、进化分群、毒力基因检测、药敏试验等方法对发生腹泻的羊场病死羊肠道、粪便样品进行检测。结果显示,从187份样品中分离到163株大肠杆菌,其... 为确定华东地区发生腹泻的羊群中大肠杆菌感染、毒力基因携带及耐药性情况,本研究通过分离鉴定、进化分群、毒力基因检测、药敏试验等方法对发生腹泻的羊场病死羊肠道、粪便样品进行检测。结果显示,从187份样品中分离到163株大肠杆菌,其中B1群及A群的菌株占大多数,检出率分别为59.51%和28.83%;B2和D群的检出率分别为9.82%和1.84%。对分离菌株31个毒力基因进行检测,结果表明yijp、crlA、mat、ompA、fimC、ibeB 6种毒力基因的检出率均大于87%;所有菌株均未检出毒力基因afa/draB和LT。fimC、mat、crlA、ibeB、yijp及ompA在各进化群大肠杆菌均广泛存在。根据毒力基因检测结果,有72株菌为产志贺毒素大肠杆菌(STEC),主要携带毒力基因stx2。STEC另一标志性毒力基因eae检出率为61.11%。药敏试验检测的16种抗菌药中有4种的耐药率大于80%,有13种大于50%。属于多重耐药(MDR)的菌株有150株,占92.02%,且多为五重及以上耐药菌(84.05%)。华东地区临床流行的羊源大肠杆菌菌株毒力基因多样、耐药性普遍且耐药性强。该结果为本地区羊大肠杆菌病的防控提供了科学依据。 展开更多

关键词 大肠杆菌 羊 分离鉴定 进化群 毒力基因 多重耐药

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猪链球菌荚膜多糖抗血清的制备及在血清分型中的应用

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作者 胡群 肖琦 +2 位作者 温立斌 彭大新 何孔旺 《江苏农业科学》 北大核心 2023年第13期189-196,共8页

为获得猪链球菌荚膜多糖及其抗血清,采用高压破碎法、乙醇分级沉淀法、酶解法以及Sevage法提取纯化了猪链球菌2、3、7、9型荚膜多糖,采用己二酸二酰肼(ADH)间桥法将荚膜多糖与牛血清蛋白(BSA)偶联,将其制备成油乳疫苗免疫BALB/c纯系雌... 为获得猪链球菌荚膜多糖及其抗血清,采用高压破碎法、乙醇分级沉淀法、酶解法以及Sevage法提取纯化了猪链球菌2、3、7、9型荚膜多糖,采用己二酸二酰肼(ADH)间桥法将荚膜多糖与牛血清蛋白(BSA)偶联,将其制备成油乳疫苗免疫BALB/c纯系雌性小鼠制备抗血清,同时制备了猪链球菌2、3、7、9型全菌灭活苗抗血清进行了间接ELISA试验及玻片试验检测。试验结果显示,制备了高纯度的荚膜多糖,对荚膜多糖-牛血清白蛋白偶联物分析,荚膜多糖偶联蛋白后的分子量变大,荚膜多糖与牛血清白蛋白偶联比为1∶1,免疫小鼠表现出较高的免疫原性。而将单独的4种荚膜多糖以及荚膜多糖与牛血清白蛋白(牛血清白蛋白)混合作为比较也免疫小鼠不能激活免疫系统产生IgG抗体,不具有免疫原性。荚膜多糖结合蛋白抗血清与全菌灭活苗抗血清同时进行交叉ELISA以及玻片凝集试验,结果表明这4型荚膜多糖结合蛋白抗血清不与其他型菌株发生反应,具有型特异性,而全菌灭活苗抗血清与其他型菌株会发生一定程度的交叉反应。此研究结果为猪链球菌亚单位疫苗的研制以及猪链球菌分型试剂的制备提供了试验依据。 展开更多

关键词 猪链球菌 荚膜多糖 抗血清 间接ELISA 玻片凝集试验

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大肠杆菌O8、O9和O89血清型三重PCR检测方法的建立

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作者 恽佳蕾 何苗锋 +9 位作者 刘润春 张梦洁 毛立 杨蕾蕾 孙敏 张纹纹 刘茂军 邹彬 王少辉 李文良 《畜牧与兽医》 CAS 北大核心 2023年第1期107-111,共5页

为建立一种快速鉴定O8、O9和O89血清型大肠杆菌的三重PCR方法,根据GenBank登录的3种血清型大肠杆菌O抗原合成基因簇序列,设计3对检测引物,通过优化反应条件建立三重PCR方法。结果:经条件优化后的三重PCR方法可有效鉴别O8、O9和O89血清... 为建立一种快速鉴定O8、O9和O89血清型大肠杆菌的三重PCR方法,根据GenBank登录的3种血清型大肠杆菌O抗原合成基因簇序列,设计3对检测引物,通过优化反应条件建立三重PCR方法。结果:经条件优化后的三重PCR方法可有效鉴别O8、O9和O89血清型的大肠杆菌,具有良好的特异性,对其他肉羊养殖场常见血清型的大肠杆菌和致病菌无特异扩增条带;敏感性检测显示,三重PCR方法对O8和O89血清型的最小检出量为10 pg/μL,对O9血清型的最小检出量为100 pg/μL;采用该方法对临床分离的大肠杆菌进行检测,结果与传统血清凝集方法一致。综上,本研究建立的三重PCR方法可快速、准确、特异地对O8、O9和O89血清型大肠杆菌进行检测,为养殖及肉品加工环节大肠杆菌的流行病学研究提供了更加快捷的检测手段。 展开更多

关键词 大肠杆菌 血清型 O8 O9 O89 三重PCR

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牛冠状病毒TaqMan荧光定量检测方法的建立及国内部分地区流行病学调查

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作者 黄金 李思远 +7 位作者 谢玲玲 周迪 杨蓉 王松 周华 蔡旭航 李基棕 李彬 《江苏农业科学》 北大核心 2023年第17期29-33,共5页

牛冠状病毒(BCoV)在全球广泛存在,在临床上能引起牛腹泻以及呼吸道感染,给养殖业带来巨大经济损失。为快速批量检测临床样品、分析国内的BCoV隐性感染及流行情况,根据BCoV的N基因序列设计了引物和探针,建立了TaqMan荧光定量RT-PCR检测方... 牛冠状病毒(BCoV)在全球广泛存在,在临床上能引起牛腹泻以及呼吸道感染,给养殖业带来巨大经济损失。为快速批量检测临床样品、分析国内的BCoV隐性感染及流行情况,根据BCoV的N基因序列设计了引物和探针,建立了TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法,对其特异性、敏感性、重复性进行评估,并将其与靶向BCoV的N基因的常规RT-PCR方法进行对比。利用本方法对采集自我国西藏、江苏、河北、贵州、安徽等5个省份的22个未发病牛场的35份口腔拭子样品和244份粪便样品进行检测以了解流行情况。结果表明,质粒标准品拷贝数的对数与C T值呈现良好稳定的负线性关系,标准曲线为y=-3.4418 x+39.5840,r^(2)=0.9994,E=98.2%;最低检测拷贝数为6.0×10拷贝/μL,重复性变异系数均<5%;对临床样品进行检测,检出率明显高于常规RT-PCR方法。对22个牛场的279份病料进行检测,结果显示BCoV的总体阳性率为73.12%,牛场阳性率为100.00%。本研究成功建立了靶向BCoV N基因、灵敏度高、特异性好的荧光定量RT-PCR检测方法,并初步掌握了我国5个省份BCoV的流行现状,为后续BCoV研究奠定了基础。 展开更多

关键词 牛冠状病毒 TaqMan荧光定量 样品检测 隐性感染 RT-PCR

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猪δ冠状病毒结构蛋白的表达及其多克隆抗体的制备

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作者 张宝太 肖丽 +9 位作者 钟纯燕 周金柱 黄金 袁雪松 蔡旭航 李思远 郭荣利 李基棕 李彬 主性 《畜牧与兽医》 CAS 北大核心 2023年第8期86-92,共7页

旨在获得猪δ冠状病毒(PDCoV)结构蛋白并评价其免疫原性。通过RT-PCR技术,扩增PDCoV CZ2020株中完整的S、E、M和N基因,克隆至pCAGGS真核表达载体,构建pCAGGS-PDCoV-S、pCAGGS-PDCoV-E、pCAGGS-PDCoV-M、pCAGGS-PDCoV-N真核表达质粒,经... 旨在获得猪δ冠状病毒(PDCoV)结构蛋白并评价其免疫原性。通过RT-PCR技术,扩增PDCoV CZ2020株中完整的S、E、M和N基因,克隆至pCAGGS真核表达载体,构建pCAGGS-PDCoV-S、pCAGGS-PDCoV-E、pCAGGS-PDCoV-M、pCAGGS-PDCoV-N真核表达质粒,经测序鉴定后转染HEK293T细胞,采用间接免疫荧光试验(IFA)和Western blot(WB)方法检测PDCoV的S、E、M、N蛋白表达。将4种蛋白分别皮下注射BALB/c小鼠,制备重组蛋白多克隆抗体,并用WB法和IFA法测定抗体效价,评价免疫原性。结果表明,重组质粒pCAGGS-PDCoV-S、pCAGGS-PDCoV-E、pCAGGS-PDCoV-M、pCAGGS-PDCoV-N能够在HEK293T细胞内正常表达,并与PDCoV阳性猪血清特异性结合。制备的4种重组蛋白的多克隆抗体效价可达1∶10 000以上,表明重组蛋白可诱导小鼠产生高水平抗体。本研究制备的多克隆抗体具有较强的免疫原性,能够为研制诊断试剂盒和新型疫苗提供基础。 展开更多

关键词 PDCoV 真核表达 抗原性分析

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非洲猪瘟病毒P30蛋白单克隆抗体制备、鉴定及阻断ELISA方法的建立 被引量：4

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作者 张冯禧 肖琦 +7 位作者 朱家平 尹力鸿 赵霞玲 严明帅 徐晋花 温立斌 牛家强 何孔旺 《中国农业科学》 CAS CSCD 北大核心 2022年第16期3256-3266,共11页

【背景】非洲猪瘟(ASF)于2018年8月在中国首次出现,对养猪业造成了巨大危害,损失惨重。目前尚无安全有效的疫苗用来预防ASF,于是建立快速特异的检测方法对于防控ASF提供了有效的手段。【目的】制备非洲猪瘟病毒(ASFV)特异性单克隆抗体,... 【背景】非洲猪瘟(ASF)于2018年8月在中国首次出现,对养猪业造成了巨大危害,损失惨重。目前尚无安全有效的疫苗用来预防ASF,于是建立快速特异的检测方法对于防控ASF提供了有效的手段。【目的】制备非洲猪瘟病毒(ASFV)特异性单克隆抗体,建立ASF快速特异性的检测方法。为ASF的检测和防控提供借鉴技术手段。【方法】构建表达载体pET-28a-P30,通过原核表达系统获得ASFV P30重组蛋白,以纯化的P30蛋白为抗原免疫BALB/c小鼠,经过细胞融合和细胞亚克隆制备出ASFV P30蛋白特异性杂交瘤细胞株;对P30蛋白进行截短表达,利用Western Blot和间接酶联免疫吸附试验(iELISA)鉴定单克隆抗体所对应的抗原表位;并利用制备的单克隆抗体建立非洲猪瘟阻断ELISA抗体检测方法。【结果】通过双酶切和PCR验证,结果显示构建出重组载体pET-28a-P30,经测序其序列未发生突变;IPTG诱导后,P30重组蛋白主要表达在包涵体中,分子量约为33 kD。纯化的P30蛋白与弗氏佐剂1:1混合免疫小鼠,3次免疫后,小鼠血清效价达到1:102400,说明表达的蛋白具有良好的免疫原性。经细胞融合和亚克隆,获得8株P30蛋白特异性杂交瘤细胞,Western Blot和间接免疫荧光试验(IFA)检测获得的8株单抗均具有良好的反应性。叠加试验显示8株单克隆抗体均针对相同的抗原位点;截短表达P30蛋白不同片段,选取制备的2-12B单克隆抗体与不同的截短P30蛋白反应,显示单克隆抗体的抗原表位区为187—194aa。利用2-12B单克隆抗体并经过条件优化,成功建立了ASF阻断ELISA抗体检测方法,检测了190份临床样品,并与商品化非洲猪瘟ELISA抗体检测试剂盒进行对比,两方法阳性符合率为90.91%,总符合率为96.32%。【结论】本研究成功获得ASFV P30蛋白,经过iELISA、Western Blot和IFA筛选出反应性良好的特异性单克隆抗体8株,抗原识别表位区为187—194aa。并利用制备的单克隆抗体建立了特异性高,敏感性好的ASFV阻断ELISA抗体检测方法,为ASF的检测及其防控提供了手段和支撑。 展开更多

关键词 非洲猪瘟病毒 P30蛋白 单克隆抗体 抗原表位 阻断ELISA

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猪流行性腹泻病毒G2a变异株CH-HK-2021的分离鉴定及其遗传进化分析 被引量：1

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作者 彭棋 张雪 +4 位作者 赫文龙 范宝超 王丹丹 刘茂军 李彬 《南方农业学报》 CAS CSCD 北大核心 2022年第8期2077-2087,共11页

【目的】明确猪流行性腹泻病毒(PEDV)变异株的遗传进化关系及变异株各亚型间的抗原性差异位点,为PEDV新型疫苗及诊断试剂盒的研发打下基础。【方法】将采集的3份PEDV阳性仔猪肠道组织样品接种至非洲绿猴肾细胞(Vero)上进行PEDV分离,分... 【目的】明确猪流行性腹泻病毒(PEDV)变异株的遗传进化关系及变异株各亚型间的抗原性差异位点,为PEDV新型疫苗及诊断试剂盒的研发打下基础。【方法】将采集的3份PEDV阳性仔猪肠道组织样品接种至非洲绿猴肾细胞(Vero)上进行PEDV分离,分别采用间接免疫荧光试验(IFA)、Western blotting、RT-PCR和电镜观察进行鉴定,通过TCID_(50)测定病毒滴度及绘制病毒体外增殖动态曲线;将分离毒株基因组分成33段进行RT-PCR扩增,使用Lasergene中的SeqMan拼接序列,然后以MEGA 7.0进行遗传进化分析,并以Protean中的Jameson-Wolf算法进行抗原性分析。【结果】其中1份PEDV阳性仔猪肠道组织样品在Vero细胞上盲传至第6代时出现典型的细胞病变,将其命名为CH-HK-2021毒株;IFA和Western blotting鉴定结果表明CH-HK-2021毒株能与小鼠抗PEDV N蛋白单克隆抗体发生特异性反应,且RT-PCR能扩增获得预期的目的条带,证实分离毒株即为PEDV。CH-HK-2021毒株的直径在80~120 nm,且病毒粒子表面带有刺突样的形状,属于冠状病毒;其在Vero细胞上能稳定传代,目前已传至100代。CH-HK-2021毒株在感染Vero细胞24 h后,其病毒滴度达最高值,为10^(5.6)TCID_(50)/mL。CH-HK-2021毒株全基因组除去poly(A)尾结构为28034 bp,与PEDV参考株在全基因组水平上的核苷酸序列相似性为96.0%~98.9%,与参考毒株S基因核苷酸序列的相似性为93.1%~99.0%,其中与变异株CH/JX/01(KX058031)的核苷酸序列相似性最高,与经典毒株AVCT12(LC053455)的核苷酸序列相似性最低。CH-HK-2021毒株属于G2a变异株,为我国当前的流行毒株。G2a毒株与G2b变异株在S基因上存在42个核苷酸差异位点,在S蛋白上则存在6处抗原性差异位点,且主要的差异位点位于S2亚基上。【结论】分离获得的CH-HK-2021毒株属于PEDV G2a变异株,为我国当前的流行毒株,与PEDV经典毒株的亲缘关系相对较远。G2a毒株和G2b变异株在S2亚基上存在多处抗原性差异位点,故推测S2亚基是导致G2a毒株与G2b变异株抗原性差异的主要原因。 展开更多

关键词 猪流行性腹泻病毒(PEDV) 变异株 分离鉴定 遗传进化分析 抗原性

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柱前衍生-气相色谱-串联质谱法检测鹅肉中青霉素G残留量 被引量：2

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作者 谢星 刘楚君 +4 位作者 陈晋元 贺兆源 卢阳 王冉 谢恺舟 《江苏农业科学》 北大核心 2021年第11期132-137,共6页

建立了鹅肉中青霉素G残留的柱前衍生-气相色谱-串联质谱检测方法。鹅肉通过加速溶剂萃取(ASE 350),0.2 mol/L磷酸盐缓冲溶液(pH值8.0)提取,所得提取液过HLB(60 mg/3 mL)固相萃取柱净化,净化液经N_2吹干后,乙醇复溶,三甲基硅烷基重氮甲烷... 建立了鹅肉中青霉素G残留的柱前衍生-气相色谱-串联质谱检测方法。鹅肉通过加速溶剂萃取(ASE 350),0.2 mol/L磷酸盐缓冲溶液(pH值8.0)提取,所得提取液过HLB(60 mg/3 mL)固相萃取柱净化,净化液经N_2吹干后,乙醇复溶,三甲基硅烷基重氮甲烷(TMSD)衍生,所得衍生产物供气相色谱-串联质谱(GC-MS/MS)检测分析,色谱柱为TG-1MS(30.0 m×0.25 mm,0.25μm),采用EI模式,全扫描(SCAN)和选择离子监测(SIM)方式定性,选择反应监测(Auto SRM)方式结合外标法定量。结果表明,鹅肉中青霉素G在4.50~100.00μg/kg添加范围时,回收率为80.67%~91.02%,相对标准偏差(RSD)为1.57%~2.58%,日内RSD为2.72%~4.47%,日间RSD为3.51%~5.14%。鹅肉中青霉素G检测限为1.50μg/kg,定量限为4.50μg/kg,该方法灵敏度高,定性、定量准确,适用于鹅肉中青霉素G残留的确证检测。 展开更多

关键词 鹅肉 青霉素G 残留 柱前衍生 气相色谱-串联质谱法

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1株羊源污蝇杆菌的分离鉴定与耐药性分析

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作者 刘润春 程子龙 +11 位作者 张梦洁 王佳婧 何苗锋 恽佳蕾 李文良 毛立 杨蕾蕾 孙敏 张纹纹 袁万哲 邹小波 刘茂军 《畜牧与兽医》 CAS 北大核心 2022年第10期97-101,共5页

污蝇杆菌(Wohlfahrtiimonas chitiniclastica)是一种新出现的人畜共患病原菌。2020年从安徽某羊厂1只口腔和舌头溃烂羊的口腔中采样并分离细菌,进行药敏试验。结果显示:分离到1株污蝇杆菌,呈β型溶血,该菌对β-内酰胺类、氨基糖苷类、... 污蝇杆菌(Wohlfahrtiimonas chitiniclastica)是一种新出现的人畜共患病原菌。2020年从安徽某羊厂1只口腔和舌头溃烂羊的口腔中采样并分离细菌,进行药敏试验。结果显示:分离到1株污蝇杆菌,呈β型溶血,该菌对β-内酰胺类、氨基糖苷类、四环素类耐药、大环内酯类、喹诺酮类、磺胺类、氟苯尼考、多黏菌素类药物均出现耐药情况,对美罗培南、替加环素敏感。这是国内首次报道羊源污蝇杆菌,但其耐药性相比之前报道菌株更严重,这对公共卫生安全具有重大挑战。 展开更多

关键词 污蝇杆菌 羊 耐药性

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