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基于AAV6-CRISPR-Cas9系统抑制NBR1表达对肺癌小鼠肿瘤免疫调控的影响
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作者 王博康 朱名扬 +1 位作者 张秀森 孙江涛 《安徽医科大学学报》 北大核心 2024年第12期2103-2111,共9页
目的以腺相关病毒(AAV)为载体,利用CRISPR-Cas9系统靶向抑制BRCA1邻近基因1(NBR1)表达,建立NBR1基因敲除的肺癌小鼠模型,并探究其对肿瘤生长和免疫细胞浸润及功能活性的影响。方法利用在线网站CRISPOR(http://crispor.tefor.net/crispor... 目的以腺相关病毒(AAV)为载体,利用CRISPR-Cas9系统靶向抑制BRCA1邻近基因1(NBR1)表达,建立NBR1基因敲除的肺癌小鼠模型,并探究其对肿瘤生长和免疫细胞浸润及功能活性的影响。方法利用在线网站CRISPOR(http://crispor.tefor.net/crispor.py)进行靶向鼠源NBR1基因(Gene ID:17966)的sgRNAs设计。使用AAV6作为sgRNAs的载体,使用PCR和DNA测序的方法确认重组病毒载体是否构建成功及确定基因敲除效率。为了确定小鼠体内最佳的AAV侵染方式,将6只C57BL/6J小鼠随机分为滴鼻组和气管内注射组,侵染28天后,通过观察小鼠肺组织冰冻切片的增强型绿色荧光蛋白表达情况,选择更有效的侵染方式进行后续实验。通过HE染色、免疫组化、组织免疫荧光和流式细胞术等方法检测小鼠肺部肿瘤生长情况以及肿瘤组织免疫细胞浸润和激活状态。结果DNA测序及荧光显微镜观察显示,AAV6-U6-sgNBR1-CAG-Cre-GFP病毒载体构建成功,且敲除效率稳定。荧光显微镜观察显示气管内给药法小鼠肺部感染病毒的效率较高(P<0.05)。HE染色结果显示靶向敲除NBR1后小鼠肺部肿瘤面积较对照组减少(P<0.01)。组织免疫荧光及流式细胞术结果显示,靶向敲除NBR1的肺癌小鼠肺癌组织中CD8^(+)T淋巴细胞功能活性较对照组增强,表现为效应型T淋巴细胞增多、耗竭型T淋巴细胞减少(P<0.01)。结论通过CRISPR/Cas9技术成功构建了靶向NBR1基因敲除的肺癌小鼠模型,验证了靶向抑制NBR1表达可明显增强肺组织CD8^(+)T淋巴细胞功能活性,使肿瘤生长受到抑制,减轻肿瘤负荷,延长肺癌小鼠生存期。为后续研究NBR1及其他基因在肺腺癌细胞中的作用机制和功能奠定了实验基础。 展开更多
关键词 肺腺癌 AAV6 CRISPR/Cas9 NBR1 基因编辑 免疫治疗
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