脂溶性维生素的生物合成 被引量：1

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作者 张博 余浩楠 +3 位作者 朱丽丹 朱溢 柳志强 郑裕国 《生物工程学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第8期2552-2569,共18页

维生素是人体正常生命活动所必需的一种有机物质,近年来维生素的应用场景不断扩展,除食品、畜牧业领域外,在医药、美妆等行业也有广泛应用,因此全球市场对维生素的需求不断增长。随着近几年合成生物学的快速发展,在现有的维生素生产方... 维生素是人体正常生命活动所必需的一种有机物质,近年来维生素的应用场景不断扩展,除食品、畜牧业领域外,在医药、美妆等行业也有广泛应用,因此全球市场对维生素的需求不断增长。随着近几年合成生物学的快速发展,在现有的维生素生产方法中生物合成法因具有环保、安全、效率高等优点,逐渐被行业研究者所关注。为了进一步实现低碳、节能、减排以及我国“碳达峰”和“碳中和”的目标,建立和实现生物合成维生素的方法具有较大的应用价值。本文综述了近年来生物合成在维生素生产领域的研究进展,详细阐述了脂溶性维生素(维生素A、维生素D、维生素E和维生素K)的生物合成研究现状。 展开更多

关键词 脂溶性维生素 生物合成 生物发酵 代谢工程 合成生物学 新质生产力

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水溶性维生素的生物合成 被引量：1

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作者 张博 廖宇哲 +3 位作者 余浩楠 王广豪 柳志强 郑裕国 《生物工程学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第8期2528-2551,共24页

维生素是维持生物体正常生理功能所必需的一类有机物质,大部分维生素无法由人体合成,少部分维生素只能有限地合成,无法满足自身需求,因而需要通过摄入含维生素的食物或药品来满足自身需要。近年来,维生素被广泛应用于医药、食品或饲料... 维生素是维持生物体正常生理功能所必需的一类有机物质,大部分维生素无法由人体合成,少部分维生素只能有限地合成,无法满足自身需求,因而需要通过摄入含维生素的食物或药品来满足自身需要。近年来,维生素被广泛应用于医药、食品或饲料添加剂、化妆品等行业中,人们对维生素的需求也不断增加。维生素的合成方法可分为化学合成法与生物合成法两大类,相较于化学法,生物法合成维生素具有环境友好、安全性高、成本低廉等优势,因此研究生物合成维生素的方法具有一定应用价值。本文综述了近年来水溶性维生素生产领域中生物合成法的研究进展,总结了水溶性维生素(B族维生素、维生素C)生物合成的研究成果,并对生物合成水溶性维生素的发展进行了展望。 展开更多

关键词 水溶性维生素 生物合成 合成生物学 代谢工程 新质生产力

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瑞舒伐他汀侧链(3R,5S)-6-R-取代基-3,5-二羟基己酸叔丁酯合成研究进展 被引量：2

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作者 何人宝 胡忠梁 +4 位作者 金逸中 林娇华 张晓健 王亚军 柳志强 《发酵科技通讯》 CAS 2017年第3期188-192,共5页

瑞舒伐他汀是一种高效的羟甲戊二酰辅酶A(HMG-CoA)还原酶抑制剂,能有效降低低密度脂蛋白(LDL)胆固醇,且无副作用,被称为"超级他汀".瑞舒伐他汀是由疏水性母核和开环侧链构成,其手性侧链是合成中的难点.目前,化学法和生物酶法... 瑞舒伐他汀是一种高效的羟甲戊二酰辅酶A(HMG-CoA)还原酶抑制剂,能有效降低低密度脂蛋白(LDL)胆固醇,且无副作用,被称为"超级他汀".瑞舒伐他汀是由疏水性母核和开环侧链构成,其手性侧链是合成中的难点.目前,化学法和生物酶法合成瑞舒伐他汀关键手性侧链(3R,5S)-6-R-取代基-3,5-二羟基己酸叔丁酯受到研究者广泛的关注.主要介绍了不对称还原合成(3R,5S)-6-R-取代基-3,5-二羟基己酸叔丁酯的研究进展. 展开更多

关键词 (3R 5S)-6-R-取代基-3 5-二羟基己酸叔丁酯 瑞舒伐他汀 手性中间体 不对称还原

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腈水解酶反应机制与催化性能调控研究进展 被引量：1

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作者 汤晓玲 郑仁朝 郑裕国 《生物加工过程》 CAS 2023年第5期485-493,共9页

腈水解酶是一类能够催化腈类化合物水解生成相应羧酸和氨的酶。因其独特的化学、区域和立体选择性,腈水解酶生物催化在高附加值羧酸等化学品的制备中具有重要应用,代表了原子经济和绿色化学的发展方向,成为生物有机合成中最为活跃的分... 腈水解酶是一类能够催化腈类化合物水解生成相应羧酸和氨的酶。因其独特的化学、区域和立体选择性,腈水解酶生物催化在高附加值羧酸等化学品的制备中具有重要应用,代表了原子经济和绿色化学的发展方向,成为生物有机合成中最为活跃的分支之一。本文综述了腈水解酶的来源、催化机制及基于结构功能构效关系的催化性能调控等方面研究进展,展望了腈水解酶的工业应用潜力,为发展腈水解酶设计改造方法、拓展其应用范围奠定基础。 展开更多

关键词 腈水解酶 反应机制 催化性能调控 工业应用 生物有机合成

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利用CRISPRi挖掘大肠杆菌生物合成D-泛酸的关键基因

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作者 张博 杨玉凤 +3 位作者 贺周霖 章誉琼 柳志强 郑裕国 《微生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2023年第12期4625-4643,共19页

【目的】D-泛酸(D-pantothenic acid,DPA)是一种重要的功能化合物,被广泛应用于医疗保健、化妆品、动物食品和饲料等领域,具有良好的市场前景及应用。本研究以实验室保藏的大肠杆菌菌株DPAP10为底盘菌株,利用CRISPR干扰(clustered regul... 【目的】D-泛酸(D-pantothenic acid,DPA)是一种重要的功能化合物,被广泛应用于医疗保健、化妆品、动物食品和饲料等领域,具有良好的市场前景及应用。本研究以实验室保藏的大肠杆菌菌株DPAP10为底盘菌株,利用CRISPR干扰(clustered regularly interspaced palindromic repeats interference,CRISPRi)技术,筛选影响工程菌株DPA生物合成的内源性基因靶点。【方法】构建了pTarget和pdCas9的双质粒CRISPRi系统,可以实现对基因单个或组合表达抑制,摇瓶发酵检测基因抑制对DPA合成的影响;通过实时荧光定量聚合酶链式反应(real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)检测了基因抑制后的转录水平;通过高效液相色谱(high performance liquid chromatography,HPLC)检测了中间代谢物分析代谢通路变化。【结果】成功从126个靶基因中筛选得到5个显著影响DPA合成的关键基因pgk、gltA、ptsH、ptsI、crp和7个基因组合pgk-gltA、pgk-ptsH、gltA-ptsH、pgk-ptsI、gltA-ptsI、pgk-crp、gltA-crp,其中菌株DPAP10/pdCas9+pT-gltA-ptsH相对于原始菌株DPAP10,在摇瓶中DPA产量提高了49.5%达到5.3 g/L,进一步在基因组上对gltA和ptsH的表达进行下调,得到工程菌株DPAP10-gltATTG-ptsHTTG,最终在5 L罐中DPA产量相较于对照菌株DPAP10在相同培养条件下提高了19.5%达到75.4 g/L。【结论】本研究证实CRISPRi筛选可以得到对DPA合成有益的基因靶点;中间代谢物检测分析发现,改变丙酮酸通量分布和降低三羧酸(tricarboxylic acid,TCA)循环速率,会导致碳流更多流向DPA合成代谢路径中,从而提高DPA的产量,这一发现为构建更高产菌株提供了新思路。 展开更多

关键词 代谢工程 大肠杆菌 D-泛酸 CRISPRi

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重组短链脱氢酶LcSDR催化(R)-1-苯基乙醇不对称合成的工艺开发 被引量：3

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作者 陈敏 王亚军 +2 位作者 柳志强 罗希 郑裕国 《化学反应工程与工艺》 CAS CSCD 北大核心 2016年第4期320-325,372,共7页

采用基因挖掘技术从Lactobacillus composti基因组中筛选到一条编码短链脱氢酶(LcSDR)的序列,该LcSDR能不对称还原苯乙酮(1a)合成(R)-1-苯基乙醇[(R)-1b]。构建了Lc SDR和葡萄糖脱氢酶(EsGDH)双酶偶联催化合成体系,优化了Lc SDR不对称还... 采用基因挖掘技术从Lactobacillus composti基因组中筛选到一条编码短链脱氢酶(LcSDR)的序列,该LcSDR能不对称还原苯乙酮(1a)合成(R)-1-苯基乙醇[(R)-1b]。构建了Lc SDR和葡萄糖脱氢酶(EsGDH)双酶偶联催化合成体系,优化了Lc SDR不对称还原1a合成(R)-1b的催化工艺参数。在较佳催化条件下,50 g/L1a转化反应2 h,产物(R)-1b得率93.8%,产物对映体过量值(eep)高于99%,该手性生物合成催化过程的时空产率达到562.8 g/(L·d)。 展开更多

关键词 短链脱氢酶 (R)-1-苯基乙醇 不对称还原 辅酶再生

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米曲霉脂肪酶催化鱼油酯酯交换制备高含量EPA/DHA甘油酯的研究 被引量：2

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作者 郑建永 张石自 +2 位作者 王升帆 李俊 汪钊 《中国油脂》 CAS CSCD 北大核心 2017年第7期111-114,共4页

利用米曲霉脂肪酶催化甘油酯型鱼油和乙酯型鱼油的酯酯交换反应制备高含量EPA/DHA甘油酯,考察了底物摩尔比、反应温度、酶添加量和摇床转速对酶催化反应的影响,得到了最优酶催化反应条件:甘油酯型鱼油与乙酯型鱼油摩尔比1∶3,酶添加量1... 利用米曲霉脂肪酶催化甘油酯型鱼油和乙酯型鱼油的酯酯交换反应制备高含量EPA/DHA甘油酯,考察了底物摩尔比、反应温度、酶添加量和摇床转速对酶催化反应的影响,得到了最优酶催化反应条件:甘油酯型鱼油与乙酯型鱼油摩尔比1∶3,酶添加量14%,反应温度70℃,摇床转速150 r/min。在最优的酶催化反应条件下反应18 h,产物甘油酯型鱼油EPA和DHA含量可达到39.72%。在优化条件下对米曲霉WZ007菌丝体重复使用6次,甘油酯型鱼油产品中的EPA和DHA含量仍保持在34.51%。 展开更多

关键词 脂肪酶 鱼油 EPA DHA 酯酯交换 米曲霉

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转氨酶的固定化及酶学性质研究 被引量：3

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作者 董正伟 朱芳莹 +2 位作者 朱文渊 田宋奎 柳志强 《发酵科技通讯》 CAS 2016年第2期81-87,共7页

利用环氧树脂载体进行固定化转氨酶的研究,通过单因素优化确定了较优的酶固定化条件:ES-103b树脂载体、转氨酶和辅酶磷酸吡哆醛最佳质量比为50∶6∶5,在p H为7.0的1mol/L磷酸钾缓冲液介质中吸附25 h。将得到的固定化颗粒重新置于pH为9.0... 利用环氧树脂载体进行固定化转氨酶的研究,通过单因素优化确定了较优的酶固定化条件:ES-103b树脂载体、转氨酶和辅酶磷酸吡哆醛最佳质量比为50∶6∶5,在p H为7.0的1mol/L磷酸钾缓冲液介质中吸附25 h。将得到的固定化颗粒重新置于pH为9.0的100 mmol/L磷酸钾缓冲液中,30℃保温30 h。取出后置于pH为8.5的3 mol/L甘氨酸-NaOH缓冲液中,25℃保温12 h,制得固定化转氨酶,其比活力为52.7 U/g(湿载体),酶活回收率达到49.3%。酶学性质研究表明:固定化转氨酶催化反应最适pH、温度分别为7.0、50℃;固定化酶热稳定性及p H稳定性明显提高,50℃条件下的半衰期为20.2 d;在pH 8.0的三乙醇胺缓冲液中(4℃),10 d后酶活仍保持初始酶活的82.3%。 展开更多

关键词 转氨酶 固定化 磷酸吡哆醛 比酶活 酶学性质

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他克莫司的发酵生产研究 被引量：4

9

作者 傅立峰 金美英 +3 位作者 单昱东 曹小燕 刘鹏 柳志强 《发酵科技通讯》 CAS 2018年第1期38-42,47,共6页

他克莫司属于第四代免疫抑制剂,是一种大环内酯类抗生素,具有较强的免疫抑制特性.首先对他克莫司生产菌株摇瓶发酵培养条件进行了优化,种子培养基中以1.5g/L的葡萄糖为碳源,种子培养时间40h,接种量10%,500mL摇瓶发酵培养基装液量为20mL... 他克莫司属于第四代免疫抑制剂,是一种大环内酯类抗生素,具有较强的免疫抑制特性.首先对他克莫司生产菌株摇瓶发酵培养条件进行了优化,种子培养基中以1.5g/L的葡萄糖为碳源,种子培养时间40h,接种量10%,500mL摇瓶发酵培养基装液量为20mL.进一步在20t发酵罐中进行放大实验,采取分批补料方式在第4天和第5天进行补料,控制溶氧在20%,最终他克莫司的质量浓度为1 150μg/mL.此外,通过对发酵提取技术和下游分离纯化工艺进行优化,发现粗提取时选择活性炭PT-A303进行萃取、脱色处理,再经过结晶、Q5亲和层析,可有效地去除结构类似物杂质,得到质量稳定的产品,最终他克莫司的收率达86.6%,纯度达99.5%. 展开更多

关键词 他克莫司 发酵 提取 精制

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代谢工程改造大肠杆菌一碳模块高效合成L-甲硫氨酸 被引量：3

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作者 张博 王莹 +2 位作者 牛坤 柳志强 郑裕国 《生物工程学报》 CAS CSCD 北大核心 2023年第8期3302-3317,共16页

L-甲硫氨酸又名L-蛋氨酸,是人体必需8种氨基酸之一,在饲料、医药、食品领域具有重要应用。以实验室前期构建的M2(Escherichia coli W3110?IJAHFEBC/PAM)为出发菌株,以模块化代谢工程策略构建了一株L-甲硫氨酸高产菌株。首先通过过表达... L-甲硫氨酸又名L-蛋氨酸,是人体必需8种氨基酸之一,在饲料、医药、食品领域具有重要应用。以实验室前期构建的M2(Escherichia coli W3110?IJAHFEBC/PAM)为出发菌株,以模块化代谢工程策略构建了一株L-甲硫氨酸高产菌株。首先通过过表达亚甲基四氢叶酸还原酶(methylenetetrahydrofolate reductase,MetF)和筛选不同来源的丝氨酸羟甲基转移酶(hydroxymethyltransferase,GlyA),增强了一碳模块甲基供体的生成,优化了一碳模块。随后针对一碳模块的前体供应,过表达了胱醚裂解酶(cysteamine lyase,MalY)和半胱氨酸内运基因(fliY),有效地提高了L-高半胱氨酸和L-半胱氨酸的供应。最终摇瓶发酵L-甲硫氨酸的产量由2.8 g/L提高至4.05 g/L,5 L发酵罐中达到18.26 g/L。研究结果表明,一碳模块对L-甲硫氨酸的生物合成具有十分重要的影响,在细胞内通过优化一碳模块,可以实现L-甲硫氨酸的高效生物合成。本研究为进一步提高微生物发酵生产L-甲硫氨酸的水平奠定了基础。 展开更多

关键词 生物合成 基因协同表达 L-甲硫氨酸 代谢工程 发酵工程

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蛋白质过硫化修饰研究进展

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作者 张博 潘佳园 +1 位作者 柳志强 郑裕国 《微生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第5期1348-1363,共16页

过硫化修饰在保护蛋白质的正常功能和信号传递过程中起着重要作用,对维持细胞的正常生理代谢平衡、保护细胞抵抗氧化应激及硫稳态调控等方面具有重要影响。本文综述了硫化氢、活性硫及半胱氨酸代谢的内在关联以及硫稳态调控,阐述了蛋白... 过硫化修饰在保护蛋白质的正常功能和信号传递过程中起着重要作用,对维持细胞的正常生理代谢平衡、保护细胞抵抗氧化应激及硫稳态调控等方面具有重要影响。本文综述了硫化氢、活性硫及半胱氨酸代谢的内在关联以及硫稳态调控,阐述了蛋白质过硫化修饰的机制及在微生物硫稳态调节中的作用,对未来的研究方向和趋势提供了新的思路。 展开更多

关键词 过硫化修饰 硫化氢 活性硫 蛋白质

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聚乙烯亚胺/戊二醛交联法固定化重组酯酶大肠杆菌细胞 被引量：7

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作者 郑建永 李天一 +1 位作者 张伟 汪钊 《生物加工过程》 CAS 2017年第3期7-11,24,共6页

利用聚乙烯亚胺/戊二醛交联法对重组酯酶大肠杆菌E.coli BL21细胞进行固定化研究,并对交联工艺条件进行优化。结果表明:在大肠杆菌细胞质量浓度200 g/L、硅藻土质量浓度2 g/L、聚乙烯亚胺(PEI)体积分数3%、交联时间1.5 h、戊二醛(GA)体... 利用聚乙烯亚胺/戊二醛交联法对重组酯酶大肠杆菌E.coli BL21细胞进行固定化研究,并对交联工艺条件进行优化。结果表明:在大肠杆菌细胞质量浓度200 g/L、硅藻土质量浓度2 g/L、聚乙烯亚胺(PEI)体积分数3%、交联时间1.5 h、戊二醛(GA)体积分数0.5%以及交联时间0.5 h时,固定化细胞的酯酶活力最高。固定化细胞的最适反应温度和pH分别为45℃和8.0,且温度稳定性和pH稳定性均高于游离细胞。当底物浓度为300mmol/L时,固定化细胞重复使用15批次后,其相对酶活仍能保留在80%以上。因此,该固定化细胞具有良好的操作稳定性。 展开更多

关键词 聚乙烯亚胺 戊二醛 固定化 交联 酯酶

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α-酮戊二酸半醛脱氢酶的定点突变及酶学性质变化 被引量：2

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作者 秦海彬 熊涛 +1 位作者 张博 牛坤 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2017年第8期180-185,共6页

3-HP是一种性质优良的化学中间体,以甘油为底物生产3-HP的研究备受青睐,而限制3-HP产量的主要原因是Ald H活力过低。对源于Azospirillam brasilense的α-酮戊二酸半醛脱氢酶(KGSADH)基因同源建模和结构分析,采用定点突变方法得到高活力K... 3-HP是一种性质优良的化学中间体,以甘油为底物生产3-HP的研究备受青睐,而限制3-HP产量的主要原因是Ald H活力过低。对源于Azospirillam brasilense的α-酮戊二酸半醛脱氢酶(KGSADH)基因同源建模和结构分析,采用定点突变方法得到高活力KGSADH,将突变酶表达纯化,探讨酶学性质的变化。结果表明,TU-KGSADH(E120D/P219A)酶活力达6.03U/mg,比原始酶比酶活提高了322%,最适温度由35℃降低为30℃,且热稳定性降低,最适p H为8.0,在p H 6.0-8.0条件下酶活力有所提高。Zn^(2+)对KGSADH的酶活有较强的抑制作用,而Co^(2+)、Fe^(3+)、Fe^(2+)对KGSADH的酶活有较大的激活作用。在酶的动力学方面,TU-KGSADH对乙醛的K_m由7.58降为6.28 mmol/L,V_(max)由10.6提高为12.3 U/mg。对酶学性质改变的因素分析发现,120位突变与最适p H下降和p H稳定性向酸性偏移有关,219位突变可能是最适温度和热稳定性降低的原因,为醛脱氢酶进一步定向改造提供参考。 展开更多

关键词 α-酮戊二酸半醛脱氢酶 定点突变 表达纯化 酶学性质

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基于碳硫模块平衡策略的大肠杆菌高产L-半胱氨酸菌株构建 被引量：2

14

作者 张博 陈开 +3 位作者 杨辉 吴梓丹 柳志强 郑裕国 《生物工程学报》 CAS CSCD 北大核心 2022年第12期4567-4586,共20页

L-半胱氨酸是一种重要的含硫氨基酸,因其多样的生理功能,L-半胱氨酸在医药、化妆品和食品工业中有着广泛的应用。模块化代谢工程策略在细胞工厂的构建中具有极大的潜力。本研究利用碳硫模块协同表达策略进行大肠杆菌的L-半胱氨酸合成途... L-半胱氨酸是一种重要的含硫氨基酸,因其多样的生理功能,L-半胱氨酸在医药、化妆品和食品工业中有着广泛的应用。模块化代谢工程策略在细胞工厂的构建中具有极大的潜力。本研究利用碳硫模块协同表达策略进行大肠杆菌的L-半胱氨酸合成途径构建,构建了一株L-半胱氨酸合成基因工程菌。首先,通过增强L-半胱氨酸前体物质L-丝氨酸(serAf、serB和serCCg)的生物合成以及转录调控因子CysB的表达,L-半胱氨酸的产量由0提高到(0.38±0.02)g/L。然后,通过促进L-半胱氨酸转运和无机硫源的吸收同化、减弱L-半胱氨酸和L-丝氨酸的降解以及异源表达cysEf和cysBSt,L-半胱氨酸的产量提升至(3.82±0.01)g/L。最后,为了优化碳模块和硫模块的代谢通量,协同表达硫酸盐同化途径与硫代硫酸盐同化途径的基因cysM、nrdH、cysK以及cysIJ,得到L-半胱氨酸高产菌株。在500 mL摇瓶和2 L发酵罐中分别实现了(4.17±0.07)g/L和(11.94±0.1)g/L的L-半胱氨酸积累。研究结果表明,在细胞内通过对硫碳模块间代谢通量的协调控制,可以实现L-半胱氨酸的高效生物合成。研究结果为微生物发酵生产L-半胱氨酸的产业化奠定了基础。 展开更多

关键词 生物合成 基因协同表达 L-半胱氨酸 代谢工程 发酵工程

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