生物技术专业免疫学实验课教学改革的初步实践 被引量：2

1

作者 孙萍 马晓君 +1 位作者 牟东珍 梁淑娟 《中国医药导报》 CAS 2009年第4期111-112,共2页

实验课是医学免疫学的重要部分,为了提高生物技术专业实验课的教学质量,适应社会需求,我们结合近几年来的实践教学经验,对免疫学实验课程体系进行了尝试性的改革,取得了较好的教学效果。

关键词 免疫学 实验课 教学改革

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卵白蛋白诱导的急性过敏性腹泻小鼠结肠组织的病理学特征

2

作者 徐灵芝 冯永堂 +5 位作者 杨京玉 邸大林 牟东珍 苗乃法 王丽娜 孙萍 《潍坊医学院学报》 2011年第2期88-90,共3页

目的 建立急性过敏性腹泻模型,观察结肠组织的病理学特征.方法 5～6周龄雌性BALB/c小鼠随机分为实验组和对照组;用卵白蛋白（OVA）和完全弗氏佐剂对实验组小鼠隔1周2次腋窝皮下预致敏,第2次致敏1周后2组小鼠均每隔1d给予等量溶解在灭菌... 目的 建立急性过敏性腹泻模型,观察结肠组织的病理学特征.方法 5～6周龄雌性BALB/c小鼠随机分为实验组和对照组;用卵白蛋白（OVA）和完全弗氏佐剂对实验组小鼠隔1周2次腋窝皮下预致敏,第2次致敏1周后2组小鼠均每隔1d给予等量溶解在灭菌PBS的OVA灌胃;于第10次灌胃后处死小鼠,取血分离血清测OVA-IgE,取结肠近端组织行HE染色观察肠组织病理改变并在油镜下计数嗜酸性粒细胞.结果 与对照组相比,实验组小鼠结肠黏膜充血水肿,上皮排列不规则,腺区有大量炎细胞浸润,固有层可见大量嗜酸性粒细胞,血清OVA-IgE水平显著升高.结论 OVA 可诱导过敏性腹泻炎症,结肠黏膜组织以充血水肿和大量嗜酸性粒细胞浸润为特征. 展开更多

关键词 腹泻 过敏性 卵白蛋白 嗜酸性粒细胞 卵白蛋白-IgE抗体

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以hsa-miR-491-3p为靶标的反义寡核苷酸对NCI-H446细胞生物学特性的影响 被引量：3

3

作者 官士珍 付玉荣 +3 位作者 伊正君 李猛 裴景亮 高昆山 《中国癌症杂志》 CAS CSCD 北大核心 2011年第3期171-176,共6页

背景与目的:miRNAs是一类小分子RNA,参与转录后调控。前期研究结果显示,hsa-miR-491-3p在肺癌和肾癌组织中高表达,目前鲜见其功能研究的报道。本研究旨在探讨以hsa-miR-491-3p为靶标的反义寡核苷酸对人小细胞肺癌NCI-H446细胞生物学特... 背景与目的:miRNAs是一类小分子RNA,参与转录后调控。前期研究结果显示,hsa-miR-491-3p在肺癌和肾癌组织中高表达,目前鲜见其功能研究的报道。本研究旨在探讨以hsa-miR-491-3p为靶标的反义寡核苷酸对人小细胞肺癌NCI-H446细胞生物学特性的影响。方法:合成以hsa-miR-491-3p为靶标的反义寡核苷酸和随机对照序列,转染NCI-H446细胞。实验分4组:空白对照组(组1)、空白转染组(组2)、随机对照组(组3)和反义寡核苷酸组(组4)。用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法筛选最佳作用浓度,Hoechst33258染色检测细胞核的形态变化,流式细胞术检测细胞凋亡和周期变化,划痕实验检测细胞的迁移能力。结果:转染反义寡核苷酸后细胞生长受到抑制,最佳作用浓度为0.5μmol/L。Hoechst33258染色各组的凋亡率分别为(6.67±0.58)%、(7.00±1.00)%、(6.67±1.53)%和(26.33±1.53)%,组4的凋亡率明显高于前3组,差异有统计学意义(P<0.001)。流式细胞仪检测各组的凋亡率分别为(2.44±0.60)%、(2.59±0.85)%、(2.62±1.11)%和(5.22±0.40)%,组4的凋亡率明显高于前3组,差异有统计学意义(P<0.01),且G1期细胞增多,S期细胞减少。划痕实验显示各组细胞24 h的迁移距离分别为(196.88±39.13)、(163.06±21.28)、(225.49±23.42)和(77.41±6.07)μm,组4细胞的迁移距离小于前3组(P<0.05),迁移能力减弱。结论:以hsa-miR-491-3p为靶标的反义寡核苷酸能够抑制NCI-H446细胞增殖,诱导其凋亡,并降低其侵袭能力。 展开更多

关键词 hsa-miR-491-3p 反义寡核苷酸 细胞凋亡 NCI-H446细胞

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人类CD252基因片段在大肠杆菌中的表达、纯化及免疫原性分析

4

作者 王成伟 潘新宇 +3 位作者 冯永堂 辛宁 鞠吉雨 苗乃法 《潍坊医学院学报》 2009年第1期26-28,I0002,共4页

目的优化表达含人类CD252胞外段的融合蛋白,纯化目的蛋白,为单克隆抗体的制备打下良好的基础。方法将测序正确的pET32a(+)-CD252胞外段重组质粒转入表达菌株BL21感受态细菌中,用SDS-PAGE电泳鉴定重组菌的诱导表达情况,通过改变pET32a(+)... 目的优化表达含人类CD252胞外段的融合蛋白,纯化目的蛋白,为单克隆抗体的制备打下良好的基础。方法将测序正确的pET32a(+)-CD252胞外段重组质粒转入表达菌株BL21感受态细菌中,用SDS-PAGE电泳鉴定重组菌的诱导表达情况,通过改变pET32a(+)-CD252阳性菌株的诱导时间、温度,以优化出最佳表达条件。采用包涵体纯化法纯化目的蛋白。用纯化的重组蛋白免疫BalB/C小鼠,采用ELISA法测定血清中抗体效价。结果成功获得表达pET32a(+)-CD252的阳性菌株。转化有pET32a(+)-CD252胞外段重组质粒的表达菌经IPTG诱导后,在蛋白分子量标准的31.0～42.7kD之间出现了新的蛋白条带,新的蛋白主要存在于包涵体中。优化表达条件分析表明,在诱导4h、温度37 ℃、IPTG浓度为1.0mmol/L时,融合蛋白的表达量最高。包涵体洗涤纯化后,经SDS-PAGE电泳证明可得到较纯的目的蛋白。免疫小鼠后测得的平均抗体效价为1:3200。结论pET32a(+)-CD252胞外段原核表达载体能够表达CD252蛋白,并获取了目的蛋白的优化表达条件,表达蛋白具有良好的免疫原性。 展开更多

关键词 CD252 融合蛋白 纯化 单克隆抗体 免疫原性

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肝癌细胞特异性IL-1β反义RNA对小鼠移植肝癌的抑制 被引量：6

5

作者 刘艳艳 梁淑娟 +3 位作者 王焕芹 张素华 肖伟玲 吴慧娜 《中国肿瘤生物治疗杂志》 CAS CSCD 北大核心 2009年第3期253-257,共5页

目的:构建肝癌细胞特异性小鼠IL-1β反义RNA表达载体,观察其对H22肝癌细胞小鼠移植瘤生长的影响及其相关机制。方法:构建由AFP最小启动子和CMV增强子嵌合序列调控的携IL-1β反义RNA表达载体pafpIRES2-antiIL-1β1和pafpIRES2-antiIL-1... 目的:构建肝癌细胞特异性小鼠IL-1β反义RNA表达载体,观察其对H22肝癌细胞小鼠移植瘤生长的影响及其相关机制。方法:构建由AFP最小启动子和CMV增强子嵌合序列调控的携IL-1β反义RNA表达载体pafpIRES2-antiIL-1β1和pafpIRES2-antiIL-1β2,经质粒PCR、限制性酶谱分析、序列测定进行鉴定。反义RNA表达载体转染小鼠H22肝癌细胞,分H22/mock组、H22/antiIL-1β1组、H22/antiIL-1β2三组,RT-PCR检测IL-1β的表达水平。以转染后的H22细胞皮下接种建立荷肝癌小鼠模型,观察移植瘤体积和重量,MTT法检测荷瘤小鼠脾脏中分离的NK细胞对H22细胞的杀伤活性。结果:经质粒PCR、限制性酶谱分析、序列测定证实成功构建能够在肝癌细胞中特异性表达IL-1β反义RNA的表达载体pafpIRES2-anti-IL-1β1和pafpIRES2-antiIL-1β2,转染H22细胞后细胞中IL-1β表达水平明显下降,以pafpIRES2-antiIL-1β2更为显著。成功建立荷肝癌小鼠模型,与H22/mock组小鼠相比,H22/antiIL-1β2组小鼠移植瘤体积较小,生长显著减慢(P<0.05)。H22/anti-IL-1β1、H22/antiIL-1β2组荷瘤小鼠的NK细胞对H22细胞的杀伤活性明显增强(P<0.05或P<0.01)。结论:成功构建的肝癌细胞特异性IL-1β反义RNA表达载体可有效抑制小鼠移植肝癌的生长,其机制与靶向阻断IL-1β表达、上调NK细胞的杀伤活性有关。 展开更多

关键词 肝癌 白细胞介素1Β 反义RNA NK细胞

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人caspase-1基因在肝癌细胞中的表达及对IL-1β水平的影响 被引量：4

6

作者 林志娟 肖伟玲 +2 位作者 王雪净 李青春 梁淑娟 《中国免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2011年第1期29-33,共5页

目的:将人caspase-1基因真核表达载体转染肝癌细胞后观察其表达水平及对IL-1β水平的影响,为研究cas-pase-1与IL-1β的关系及其在慢性炎症与肿瘤中的作用提供依据。方法:利用阳离子聚合物(jetPEI)将pIRES2-EGFP-caspase-1重组表达载体和... 目的:将人caspase-1基因真核表达载体转染肝癌细胞后观察其表达水平及对IL-1β水平的影响,为研究cas-pase-1与IL-1β的关系及其在慢性炎症与肿瘤中的作用提供依据。方法:利用阳离子聚合物(jetPEI)将pIRES2-EGFP-caspase-1重组表达载体和pIRES2-EGFP对照载体转染人肝癌细胞HepG2(HepG2/caspase-1、HepG2/mock),48小时后倒置相差荧光显微镜下观察表达情况,利用RT-PCR、Western blot方法检测两组细胞caspase-1表达水平,采用caspase-1底物显色分析研究的方法检测两组细胞中caspase-1的活性。夹心ELISA法检测细胞培养上清以及细胞裂解液中IL-1β的表达水平。结果:转染48小时后倒置相差显微镜下可见,pIRES2-EGFP-caspase-1和pIRES2-EGFP重组表达载体均能在HepG2细胞中高效表达;HepG2/caspase-1细胞中caspase-1 mRNA表达水平显著提高;经LPS刺激后,HepG2/caspase-1细胞中caspase-1总蛋白的水平明显升高;caspase-1的生物活性水平与对照组相比具有显著性差异(t=25.679,P<0.05);HepG2/caspase-1细胞培养上清中IL-1β的水平明显高于HepG2/mock组细胞(t=3.417,P<0.05),胞浆裂解液中的变化相对不显著(t=2.396,P>0.05)。结论:人caspase-1基因真核表达载体pIRES2-EGFP-caspase-1能够在肝癌细胞中高效表达caspase-1,且该重组表达载体在HepG2细胞中能提高活性IL-1β的表达。 展开更多

关键词 CASPASE-1 肝癌细胞 IL-1Β 炎症

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AFP启动子调控的小鼠IL-1β重组载体的构建及其在肝癌H22细胞中的表达 被引量：3

7

作者 李青春 梁淑娟 +3 位作者 王雪净 刘艳艳 王焕芹 张素华 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2009年第7期603-605,共3页

目的:构建小鼠甲胎蛋白(AFP)启动子调控的小鼠IL-1β(mIL-1β)重组真核表达载体pafpIRES2-EGFP-mIL-1β,并检测其在真核细胞内的表达。方法:重叠延伸PCR技术(SOE-PCR)获得含小鼠AFP最小启动子及巨细胞病毒(CMV)增强子区(ECMV)的嵌合基因... 目的:构建小鼠甲胎蛋白(AFP)启动子调控的小鼠IL-1β(mIL-1β)重组真核表达载体pafpIRES2-EGFP-mIL-1β,并检测其在真核细胞内的表达。方法:重叠延伸PCR技术(SOE-PCR)获得含小鼠AFP最小启动子及巨细胞病毒(CMV)增强子区(ECMV)的嵌合基因,将其克隆至pIRES2-EGFP载体,构建肝癌细胞特异性表达载体pafpIRES2-EGFP。RT-PCR扩增小鼠IL-1β基因,克隆至pafpIRES2-EGFP,进行酶谱分析及DNA序列测定。利用jetPEI法将其分别转染H22细胞和YAC-1细胞,倒置相差荧光显微镜下观察,RT-PCR分析mIL-1β表达水平的变化。结果:SOE-PCR方法获得长度为537bp的AFP和ECMV嵌合基因,克隆后经限制性酶切和DNA序列分析确认成功构建了小鼠肝癌细胞特异性表达载体pafpIRES2-EGFP。PCR扩增小鼠IL-1β基因后将其克隆至pafpIRES2-EGFP,获得AFP启动子调控的小鼠IL-1β重组真核表达载体pafpIRES2-EGFP-mIL-1β,细胞转染分析证实,该载体能够在小鼠肝癌细胞中特异性高效表达,RT-PCR检测可见转染细胞中mIL-1β水平明显升高。结论:成功构建真核表达载体pafpIRES2-EGFP-mIL-1β,该载体能够在小鼠肝癌细胞中特异性表达IL-1β。 展开更多

关键词 IL-1Β AFP启动子 组织特异性 肝癌

原文传递

IL-1β对Hepa1-6细胞增殖、迁移及IFN应答的影响 被引量：1

8

作者 林志娟 梁淑娟 +2 位作者 王焕芹 李艳平 肖伟玲 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2011年第2期139-142,共4页

目的:构建应用于小鼠肝脏内表达和研究的IL-1β肝癌细胞特异性表达载体,观察其对小鼠Hepa1-6细胞体外增殖活性、迁移能力及干扰素增殖抑制效应等体外生物学行为的影响。方法:由C57BL/6小鼠腹腔液巨噬细胞扩增IL-1β基因,构建肝脏特异性p... 目的:构建应用于小鼠肝脏内表达和研究的IL-1β肝癌细胞特异性表达载体,观察其对小鼠Hepa1-6细胞体外增殖活性、迁移能力及干扰素增殖抑制效应等体外生物学行为的影响。方法:由C57BL/6小鼠腹腔液巨噬细胞扩增IL-1β基因,构建肝脏特异性pLIVE-IL-1β重组表达载体。利用transIT-LT1将鉴定后的pLIVE-IL-1β转染至Hepa1-6肝癌细胞,RT-PCR及双抗体夹心ELISA法分析转染前后IL-1表达水平,MTT法分析IL-1对细胞体外增殖活性的影响;利用细胞划痕实验分析对其迁移能力的影响,并确定对IFN-α诱导的细胞增殖抑制效应的作用。结果:重组载体经限制性酶谱分析酶解出822bp的条带,其序列与GenBank登录的小鼠IL-1β基因一致;转染后的Hepa1-6细胞培养上清中IL-1β的表达明显增高,细胞体外增殖速度明显加快;给予IFN-α作用后,IL-1β的表达使细胞对干扰素的抵抗性明显增强。结论:小鼠IL-1β肝癌组织特异性表达载体pLIVE-IL-1β能够在小鼠肝癌细胞中高效表达IL-1β,并能够显著促进肿瘤的体外增殖和迁移能力,削弱IFN-α对Hepa1-6细胞的增殖抑制作用。 展开更多

关键词 IL-1Β 肝癌 NK细胞 促炎性细胞因子 干扰素

原文传递

RNA干扰与肿瘤基因治疗 被引量：3

9

作者 鞠吉雨 李在连 《食品与药品》 CAS 2009年第1期54-57,共4页

RNA干扰(RNAi)是控制正常基因表达的一种机制,近来作为一种潜在的技术用于肿瘤、传染病和代谢性疾病的治疗。本文仅就RNA干扰的发现、作用机制以及在肿瘤治疗中的应用和所面临的问题做一简要介绍。

关键词 RNA干扰 小干扰RNA 基因沉默 肿瘤

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pLIVE-IL-1β表达载体的构建及在Hepa1-6细胞的表达 被引量：1

10

作者 王焕芹 梁淑娟 +3 位作者 刘艳艳 李青春 肖伟玲 李若葆 《潍坊医学院学报》 2008年第3期196-198,共3页

目的构建应用于体内表达和研究的小鼠IL-1β肝癌细胞特异性表达载体,观察其在小鼠HE-PA1-6细胞中的表达水平。方法分离BALB/c小鼠外周血淋巴细胞,LPS刺激后提到总RNA,RT-PCR扩增IL-1β基因,与pLIVETM连接构建pLIVE-IL-1β重组表达载体,... 目的构建应用于体内表达和研究的小鼠IL-1β肝癌细胞特异性表达载体,观察其在小鼠HE-PA1-6细胞中的表达水平。方法分离BALB/c小鼠外周血淋巴细胞,LPS刺激后提到总RNA,RT-PCR扩增IL-1β基因,与pLIVETM连接构建pLIVE-IL-1β重组表达载体,并通过菌落PCR、限制性酶谱分析、DNA序列分析进行鉴定。利用TransITTM将pLIVE-IL-1β转染至Hepa1-6肝癌细胞,RT-PCR分析IL-1β的表达水平。结果从小鼠腹腔巨噬细胞中RT-PCR扩增得到一822bp的片段,纯化的PCR产物与pLIVETM同时经XhoⅠ和NheⅠ双酶切后连接,菌落PCR鉴定获得多个阳性克隆,经质粒XhoⅠ+NheⅠ限制性酶谱分析,酶解出822bp的条带,DNA序列分析证实重组载体中的DNA序列与GeneBank登录的小鼠IL-1β基因一致。将该载体转染Hepa1-6细胞,RT-PCR证实,与转染pLIVETM的对照细胞相比,IL-1β的表达水平明显升高。结论成功构建了小鼠IL-1β肝癌组织特异性表达载体pLIVE-IL-1β,该载体能够在小鼠肝癌细胞中稳定高效表达IL-1β。 展开更多

关键词 肝癌 IL-1Β pLIVETM 促炎性细胞因子

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mIL-21/PcDNA3.1真核表达载体的构建及鉴定 被引量：1

11

作者 王丽娜 林志娟 +4 位作者 鞠吉雨 李芳娜 冯永堂 孙萍 苗乃发 《潍坊医学院学报》 2009年第3期179-180,192,共3页

目的构建mIL-21/PcDNA3.1真核表达载体。方法从ConA活化的BALB/c小鼠脾细胞中抽提总RNA,RT-PCR方法扩增小鼠IL-21基因,XhoⅠ和HindⅢ双酶切后克隆入真核细胞高效表达载体pcD NA3.1中,构建小鼠IL-21真核表达载体mIL-21/PcDNA3.1,并经PCR... 目的构建mIL-21/PcDNA3.1真核表达载体。方法从ConA活化的BALB/c小鼠脾细胞中抽提总RNA,RT-PCR方法扩增小鼠IL-21基因,XhoⅠ和HindⅢ双酶切后克隆入真核细胞高效表达载体pcD NA3.1中,构建小鼠IL-21真核表达载体mIL-21/PcDNA3.1,并经PCR、限制性酶谱分析和DNA序列分析对重组子的正确性进行鉴定。结果构建的小鼠IL-21真核表达载体mIL-21/PcDNA3.1经PCR、限制性酶谱分析和DNA序列分析证明获得了目的基因,其序列与Genbank中登录的小鼠IL-21基因序列完全一致。结论成功构建了mIL-21/PcDNA3.1真核表达载体,为IL-21分子的进一步研究奠定了基础。 展开更多

关键词 IL-21 IL-21/PcDNA3.1 真核表达

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小鼠分泌型IL-1β真核表达载体的构建及其表达

12

作者 肖伟玲 王雪净 +3 位作者 牟东珍 林志娟 王焕芹 梁淑娟 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2011年第7期744-746,共3页

目的:构建小鼠经典分泌途径IL-1β真核表达载体,转染至Hepa1-6细胞,并测定其分泌表达水平。方法:引物延伸获得小鼠AFP信号肽序列(sAFP),RT-PCR扩增获得小鼠IL-1β成熟蛋白基因序列(mIL-1β),SOE方法将两段序列拼接形成融合基因,与pIRES2... 目的:构建小鼠经典分泌途径IL-1β真核表达载体,转染至Hepa1-6细胞,并测定其分泌表达水平。方法:引物延伸获得小鼠AFP信号肽序列(sAFP),RT-PCR扩增获得小鼠IL-1β成熟蛋白基因序列(mIL-1β),SOE方法将两段序列拼接形成融合基因,与pIRES2-EGFP质粒重组构建分泌型真核表达载体pIRES2-EGFP-smIL-1β,并将其转染至Hepa1-6细胞,RT-PCR检测融合基因的表达水平,Western blot检测细胞内mIL-1β蛋白的表达,ELISA法测定培养上清及细胞裂解液中mIL-1β水平。结果:经SOE法拼接获得的融合基因与GenBank中登录的序列一致,RT-PCR检测显示该载体能够在Hepa1-6细胞中表达融合基因mRNA,细胞培养上清中mIL-1β的分泌水平明显上升,而胞质中的mIL-1β无明显变化。结论:成功地构建了经典途径分泌的mIL-1β重组表达载体,该载体可以在Hepa1-6细胞培养上清中有效分泌具有生物活性的mIL-1β。 展开更多

关键词 鼠白细胞介素1β 信号肽 分泌表达 肝癌细胞

原文传递

白细胞介素-1在肿瘤靶向治疗策略中的价值

13

作者 刘艳艳 梁淑娟 《食品与药品》 CAS 2009年第2期53-57,共5页

白细胞介素-1(IL-1)家族成员是一类重要的促炎性细胞因子,近年研究证实,该家族的因子不仅是体内免疫调节和炎症反应的核心介质,而且在许多肿瘤形成和进展中起着重要作用,以IL-1为靶向针对其合成及信号转导途径各层次的治疗策略,如ICE抑... 白细胞介素-1(IL-1)家族成员是一类重要的促炎性细胞因子,近年研究证实,该家族的因子不仅是体内免疫调节和炎症反应的核心介质,而且在许多肿瘤形成和进展中起着重要作用,以IL-1为靶向针对其合成及信号转导途径各层次的治疗策略,如ICE抑制剂、NF-κB抑制剂、IL-1Ra等均显示了在肿瘤治疗中的价值。 展开更多

关键词 白细胞介素1 肿瘤 靶向治疗

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mOX40-hIgG1Fc真核表达载体的构建

14

作者 刘艳菲 冯永堂 +3 位作者 林志娟 许传武 史琳 苗乃法 《潍坊医学院学报》 2008年第3期205-207,共3页

目的构建mOX40-hIgG1Fc的真核表达载体。方法从正常人外周血单个核细胞中提取总RNA,应用RT-PCR法扩增获得hIgG1Fc段基因,将其插入pcDNA3.1,构建pcDNA3.1-hIgG1Fc重组质粒。进而从本室保存的pIRES2-EGFP-mOX40重组质粒中PCR扩增mOX40胞外... 目的构建mOX40-hIgG1Fc的真核表达载体。方法从正常人外周血单个核细胞中提取总RNA,应用RT-PCR法扩增获得hIgG1Fc段基因,将其插入pcDNA3.1,构建pcDNA3.1-hIgG1Fc重组质粒。进而从本室保存的pIRES2-EGFP-mOX40重组质粒中PCR扩增mOX40胞外段,再利用pcDNA3.1-hIgG1Fc重组载体构建pcDNA3.1-mOX40-hIgG1Fc真核表达载体,并经PCR、限制性酶谱分析和测序分析进行证实。结果构建的pcDNA3.1-mOX40-hIgG1Fc真核表达载体,经PCR、限制性酶谱分析和测序分析,证实获得的hIgG1Fc段及mOX40胞外段基因均与国际生物信息资源库GenBank登录的相应基因序列完全一致。结论成功构建pcD-NA3.1-mOX40-hIgG1Fc真核表达载体,为OX40分子的进一步研究奠定良好的基础。 展开更多

关键词 OX40 mOX40-hIgG1 FC 真核表达

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IL-1β反义RNA表达载体的构建及对肝癌细胞中IL-1β水平的影响

15

作者 梁淑娟 吴慧娜 +2 位作者 肖伟玲 牟东珍 刘艳艳 《潍坊医学院学报》 2008年第3期193-195,共3页

目的构建小鼠IL-1β反义RNA表达载体,观察对肝癌细胞中IL-1β表达的阻断效果。方法提取细胞总RNA,RT-PCR扩增IL-1β1和IL-1β2,将其反向连接到肝癌组织特异性表达载体PafpIRES2-EGFP,构建PafpIRES2-antiIL-1β1和PafpIRES2-antiIL-1β2... 目的构建小鼠IL-1β反义RNA表达载体,观察对肝癌细胞中IL-1β表达的阻断效果。方法提取细胞总RNA,RT-PCR扩增IL-1β1和IL-1β2,将其反向连接到肝癌组织特异性表达载体PafpIRES2-EGFP,构建PafpIRES2-antiIL-1β1和PafpIRES2-antiIL-1β2反义RNA表达载体,利用jetPEI转染H22肝癌细胞和YAC-1淋巴细胞,荧光显微镜下观察反义RNA载体的表达,RT-PCR方法分析H22细胞中IL-1β表达水平的变化。结果RT-PCR扩增到两条长度分别为264和284bp的片段,与IL-1β1和IL-1β2相符,将其反向与PafpIRES2-EGFP连接,经菌落PCR和DNA序列分析证实,获得了PafpIRES2-antiIL-1β1和PafpIRES2-antiIL-1β2反义RNA表达载体。上述载体转染H22细胞后,荧光显微镜下可见细胞表达出明亮绿色荧光,而YAC-1细胞则未见荧光。RT-PCR分析证实转染反义RNA后H22细胞中IL-1β表达水平明显下降,尤以IL-1β2反义RNA的阻断效果更为显著。结论成功构建了小鼠IL-1β肝癌细胞特异性反义RNA表达载体PafpIRES2-antiIL-1β1,PafpIRES2-antiIL-1β2,两载体能有效地阻断肝癌细胞中IL-1β的表达。 展开更多

关键词 IL-1Β 反义RNA 肝癌

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小鼠OX40原核表达载体的构建及表达

16

作者 林志娟 刘艳菲 +3 位作者 冯永堂 许传武 杜雪梅 苗乃法 《潍坊医学院学报》 2008年第3期202-204,共3页

目的构建小鼠OX40胞外段基因的原核表达载体并进行诱导表达。方法PCR扩增OX40胞外段基因并将其插入原核表达质粒pET32a(+),重组pET32a-OX40经测序鉴定后转入表达菌株BL21(DE3)进行融合蛋白的小量诱导表达。结果出现新增蛋白条带,融合蛋... 目的构建小鼠OX40胞外段基因的原核表达载体并进行诱导表达。方法PCR扩增OX40胞外段基因并将其插入原核表达质粒pET32a(+),重组pET32a-OX40经测序鉴定后转入表达菌株BL21(DE3)进行融合蛋白的小量诱导表达。结果出现新增蛋白条带,融合蛋白主要存在于包涵体中;Western Blotting分析表明该融合蛋白可与相应抗体发生特异性结合。结论构建了小鼠OX40基因的原核表达载体,获得OX40胞外段融合蛋白。 展开更多

关键词 OX40 载体构建 原核表达

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rhIL-12逆转录病毒双亚基共表达载体的转化和鉴定

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作者 李娜 曲春枫 +2 位作者 吕娥 苗乃法 吴国庆 《潍坊医学院学报》 2008年第3期208-210,I0001,共4页

目的以人白细胞介素-12(IL-12)双亚基共表达载体pL35P40SN转化大肠杆菌DH5α,并对转化载体进行鉴定。方法以构建好的IL-12双亚基共表达载体pL35P40SN及其对照载体pLXPXSN转化大肠杆菌DH5α,氨苄抗性平板筛选阳性克隆,提取阳性克隆质粒... 目的以人白细胞介素-12(IL-12)双亚基共表达载体pL35P40SN转化大肠杆菌DH5α,并对转化载体进行鉴定。方法以构建好的IL-12双亚基共表达载体pL35P40SN及其对照载体pLXPXSN转化大肠杆菌DH5α,氨苄抗性平板筛选阳性克隆,提取阳性克隆质粒并对其进行酶切及PCR鉴定。结果以XhoI酶切后鉴定,对照载体和IL-12共表达载体的条带分别在6490bp和8800bp的位置,以IL-12 p35和p40引物PCR扩增后电泳鉴定,在700bp和1000bp处可见清亮电泳条带。结论含IL-12 p35和p40双亚基基因的pL35P40SN载体成功转入大肠杆菌DH5α,经多项鉴定结果正确。为以其转染细胞并对IL-12的功能研究打下良好基础。 展开更多

关键词 IL-12 转化 载体

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肝癌组织特异性P_(afp)IRES2-EGFP表达载体的构建及表达

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作者 牟东珍 梁淑娟 +3 位作者 刘艳艳 王雪净 吴慧娜 李若葆 《潍坊医学院学报》 2008年第3期199-201,I0001,共4页

目的构建AFP最小启动子调控的小鼠肝癌组织特异性表达载体,观察其在小鼠H22肝癌细胞中的特异性表达。方法从H22细胞总DNA和荧光载体pIRES2-EGFP中分别PCR扩增AFP最小启动子区序列和CMV增强子(ECMV),利用重叠延伸PCR方法(SOE)获得AFP启... 目的构建AFP最小启动子调控的小鼠肝癌组织特异性表达载体,观察其在小鼠H22肝癌细胞中的特异性表达。方法从H22细胞总DNA和荧光载体pIRES2-EGFP中分别PCR扩增AFP最小启动子区序列和CMV增强子(ECMV),利用重叠延伸PCR方法(SOE)获得AFP启动子驱动的嵌合调控序列,将其克隆入pIRES2-EGFP载体,进行菌落PCR、限制性酶谱分析、DNA序列测定。通过jetPEI方法转染H22肝癌细胞和YAC1淋巴瘤细胞,荧光显微镜下观察其表达的组织特异性。结果从小鼠H22细胞DNA和pIRES2-EGFP中分别扩增得到229bp和324bp的片段,纯化后的PCR产物通过SOE扩增得到一537bp的条带,均与预期序列长度一致。SOE产物与pIRES2-EGFP连接,菌落PCR鉴定获得数个阳性克隆,质粒经Nde I+NheⅠ限制性酶谱分析酶解出537bp条带,DNA序列分析证实重组载体中的嵌合DNA与GeneBank中小鼠AFP启动子和ECMV序列完全一致。结论本研究成功构建了AFP启动子调控的小鼠肝癌组织特异性表达载体PafpIRES2-EGFP,该载体能够在小鼠肝癌细胞中特异性表达外源基因。 展开更多

关键词 肝癌 组织特异性表达 AFP启动子

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鼠IL-35真核表达载体的构建及在Hepa1-6细胞中的表达

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作者 朱平 鞠吉雨 +4 位作者 唐媛媛 邸大琳 王丽娜 孙萍 苗乃法 《潍坊医学院学报》 2012年第1期41-43,66,共4页

目的 构建小鼠IL-35的真核表达载体并使其在小鼠肝癌细胞株Hepa1-6中表达.方法 采用PCR方法从含有小鼠IL-35基因的pET-30a-mIL-35中扩增目的 基因片段,将其克隆到真核表达载体pcDNA3.1/V5-HisB中,经菌落PCR、双酶切鉴定及测序正确后,用... 目的 构建小鼠IL-35的真核表达载体并使其在小鼠肝癌细胞株Hepa1-6中表达.方法 采用PCR方法从含有小鼠IL-35基因的pET-30a-mIL-35中扩增目的 基因片段,将其克隆到真核表达载体pcDNA3.1/V5-HisB中,经菌落PCR、双酶切鉴定及测序正确后,用脂质体转染方法转染到Hepa1-6细胞中,48h后收集细胞,SDS-PAGE和Western Blotting检测目的 蛋白的表达.结果 经双酶切和测序鉴定证实重组表达载体构建成功,转染入Hepa1-6细胞经SDS-PAGE电泳和Western Blotting证明均得到与预期相对分子量大小相符的蛋白条带.结论 成功构建小鼠IL-35真核表达载体并在Hepa1-6细胞中表达,为进一步研究mIL-35的生物学功能提供了条件. 展开更多

关键词 mIL-35 载体构建 Hepa1-6

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抑癌基因BCSC-1原核表达载体的构建及诱导表达

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作者 袁芳 鞠吉雨 +3 位作者 王丽娜 邸大琳 刘艳菲 冯永堂 《潍坊医学院学报》 2010年第1期41-43,共3页

目的 构建BCSC-1基因原核表达载体并进行诱导表达、纯化.方法 PCR方法从腺病毒穿梭载体pDC316-BCSC-1扩增BCSC-1基因,构建原核表达载体ET30a-BCSC-1,转化感受态E.coli BL21（DE3）,并用IPTG进行诱导表达.SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳方法检... 目的 构建BCSC-1基因原核表达载体并进行诱导表达、纯化.方法 PCR方法从腺病毒穿梭载体pDC316-BCSC-1扩增BCSC-1基因,构建原核表达载体ET30a-BCSC-1,转化感受态E.coli BL21（DE3）,并用IPTG进行诱导表达.SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳方法检测目的 蛋白的表达,并用超声洗涤方法进行目的 蛋白洗涤纯化.结果 成功构建原核表达载体pET30a-BCSC-1;在IPTG诱导下在E.coli BL21（DE3）中高效表达相对分子质量（Mr）为86 000的重组BCSC-1蛋白,目的 蛋白主要以包涵体的形式存在于沉淀中,经超声洗涤纯化后,重组蛋白纯度可达85%以上.结论 利用构建的原核表达载体成功表达出BCSC-1蛋白,为进一步制备抗BCSC-1的单克隆抗体及在临床中的应用打下良好基础. 展开更多

关键词 BCSC-1蛋白 载体构建 原核表达

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