布鲁氏菌效应蛋白BspE基因缺失株的构建及其生物学特性研究

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作者 张思岚 支飞杰 +6 位作者 丁剑 宋银娟 郑福英 付强 储岳峰 史慧君 许健 《中国畜牧兽医》 CAS CSCD 北大核心 2024年第12期5128-5137,共10页

【目的】构建牛种布鲁氏菌(B.abortus)A19株效应蛋白BspE基因缺失株,探究其生长特性及在宿主细胞中的生存、黏附及入侵能力,并观察BspE蛋白的亚细胞定位情况。【方法】以牛种布鲁氏菌A19为研究对象,运用同源重组及SacB反向筛选技术构建... 【目的】构建牛种布鲁氏菌(B.abortus)A19株效应蛋白BspE基因缺失株,探究其生长特性及在宿主细胞中的生存、黏附及入侵能力,并观察BspE蛋白的亚细胞定位情况。【方法】以牛种布鲁氏菌A19为研究对象,运用同源重组及SacB反向筛选技术构建布鲁氏菌效应蛋白BspE基因缺失株A19ΔBspE,并通过质粒回补方法构建其回补株A19CΔBspE,比较3种菌株在体外的生长特性;通过平板计数方法分析BspE基因缺失对布鲁氏菌在细胞内的生存及黏附和入侵细胞能力的影响;通过间接免疫荧光试验检测BspE蛋白在RAW264.7细胞中的定位情况。【结果】菌液PCR结果显示,获得大小为2060 bp的特异性条带,成功构建BspE基因缺失株A19ΔBspE;Western blotting结果显示,获得大小约为14.59 ku的BspE-flag条带,成功构建回补株A19CΔBspE。生长曲线结果显示,在相同的培养条件下,A19ΔBspE与牛种布鲁氏菌A19、A19CΔBspE的生长趋势没有显著差异(P>0.05),均在8 h达对数生长期,32 h进入平台期。胞内增殖试验结果显示,在感染48 h内,A19ΔBspE在RAW264.7细胞中的生存能力与牛种布鲁氏菌A19、A19CΔBspE无显著差异(P>0.05)。细菌黏附和入侵试验结果显示,A19ΔBspE黏附和入侵RAW264.7细胞的能力与牛种布鲁氏菌A19、A19CΔBspE没有显著差异(P>0.05)。间接免疫荧光试验结果显示,BspE蛋白主要分布于核周区域。【结论】本研究证实了BspE基因的缺失不影响布鲁氏菌在体外的生长及在RAW264.7细胞中的生存、黏附及入侵能力,且BspE蛋白主要定位在核周区域,为后续研究布鲁氏菌效应蛋白BspE的生物学功能和致病机制奠定基础。 展开更多

关键词 布鲁氏菌 效应蛋白BspE 突变株 生物学特性

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HIF-1α在病原体感染中的作用研究进展 被引量：1

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作者 张正洋 宋银娟 储岳峰 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第6期2357-2367,共11页

缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)是细胞应对缺氧反应的中枢调节因子,稳定的HIF-1α具有多种功能,参与血管生成、代谢调节、细胞自噬及细胞凋亡等多种生物学过程。HIF-1α的稳定性受到多种信号的调节,包括氧气水平、病原体感染以及代谢中间体... 缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)是细胞应对缺氧反应的中枢调节因子,稳定的HIF-1α具有多种功能,参与血管生成、代谢调节、细胞自噬及细胞凋亡等多种生物学过程。HIF-1α的稳定性受到多种信号的调节,包括氧气水平、病原体感染以及代谢中间体等。近年来,越来越多的研究表明,HIF-1α在感染性疾病中起着重要作用。因此,本文就HIF-1α稳定性的调节机制及其在病毒、细菌等病原体感染和相关疾病发生发展中的作用进行讨论和总结,旨在为进一步解析HIF-1α在防御多种病原体感染中的作用和其作为靶向治疗的潜在靶点等相关研究提供参考。 展开更多

关键词 HIF-1Α 稳定性 病原体 感染 作用机制

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单链DNA退火蛋白介导细菌基因组同源重组的机制及应用研究进展

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作者 尹号 尤留超 +3 位作者 韩瑞 高鹏程 付磊 储岳峰 《生物技术通报》 北大核心 2025年第1期39-48,共10页

基因组编辑技术是研究细菌等微生物在基因功能、耐药机制及致病机制等方面的重要工具,而同源重组是细菌基因组编辑的重要方式之一,传统的细菌内源性重组途径存在效率低下的问题,而一种来自噬菌体的单链DNA退火蛋白(SSAP)表现出了远超内... 基因组编辑技术是研究细菌等微生物在基因功能、耐药机制及致病机制等方面的重要工具,而同源重组是细菌基因组编辑的重要方式之一,传统的细菌内源性重组途径存在效率低下的问题,而一种来自噬菌体的单链DNA退火蛋白(SSAP)表现出了远超内源性重组途径的基因组编辑效率,该蛋白具有单链DNA结合活性、介导基因组定向重组的特点,使其成为目前极具潜力的基因组编辑工具。本文主要对同源重组基本原理、噬菌体源SSAP介导的同源重组途径的基本元件、重组机制模型以及应用策略展开概述,旨在为进一步解析单链DNA退火蛋白介导的同源重组过程提供帮助,为研究更多细菌基因功能、致病机制以及开发工程菌株提供技术支撑,也为缺乏基因编辑方法的细菌提供技术参考。 展开更多

关键词 细菌 单链DNA退火蛋白 同源重组 机制 应用

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牛支原体能量耦合因子转运蛋白S组件Mb BioY摄取外源生物素的功能分析

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作者 陈启伟 权衡 +5 位作者 陈胜利 刘东慧 于永峰 李彩玉 宫晓炜 储岳峰 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第1期282-289,共8页

牛支原体(M.bovis)感染与生存依赖于外界微环境提供的各类营养代谢因子。开展M.bovis外源生物素摄取的机制研究,将对M.bovis防控具有极其重要的意义。通过对M.bovis PG45 Mb BioY(MBOVPG45_0349)基因进行系统发育分析、分子对接分析,筛... 牛支原体(M.bovis)感染与生存依赖于外界微环境提供的各类营养代谢因子。开展M.bovis外源生物素摄取的机制研究,将对M.bovis防控具有极其重要的意义。通过对M.bovis PG45 Mb BioY(MBOVPG45_0349)基因进行系统发育分析、分子对接分析,筛选M.bovis PG45 Mb BioY突变株,比较PG45和PG45ΔMb BioY的生物素敏感性,异源构建Mb BioY功能性克隆验证其功能。结果表明,PG45染色体上存在一种崭新的生物素膜转运蛋白,全长996 bp,GC含量30.95%,蛋白长度为332个氨基酸,是由7个跨膜结构域组成的能量偶合因子(ECF)转运蛋白S成分Mb BioY。进一步验证后发现,当M.bovis缺失Mb BioY会影响其生长,表现出生物素代谢营养缺陷的表型。通过异源敲入生物素代谢营养缺陷大肠杆菌MG1655,表明Mb BioY单独存在时,就能够恢复生物素代谢营养缺陷大肠杆菌缺失株的生理功能。初步证明,Mb BioY编码的是能量偶合因子(ECF)转运蛋白的S成分具有摄取外源生物素的能力,该研究结果将补充细菌生物素代谢调控的多样性和复杂性,为M.bovis的有效防控提供独特视角。 展开更多

关键词 牛支原体 能量耦合因子转运体 生物素 转运

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口蹄疫病毒O型东南亚拓扑型抗原变异研究

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作者 王莉 李坤 +4 位作者 黄书伦 李凤娟 王省 卢曾军 刘在新 《中国农业科学》 CAS CSCD 北大核心 2024年第15期3093-3104,共12页

【目的】O型口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus,FMDV)不断变异,易导致现用疫苗与流行毒株的抗原匹配性下降引起免疫效果不佳,疫情零星散发。近年来,O型FMDV中SEA(东南亚)拓扑型流行活跃且不断变异,持续对口蹄疫防疫产生压力。系... 【目的】O型口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus,FMDV)不断变异,易导致现用疫苗与流行毒株的抗原匹配性下降引起免疫效果不佳,疫情零星散发。近年来,O型FMDV中SEA(东南亚)拓扑型流行活跃且不断变异,持续对口蹄疫防疫产生压力。系统解析O型FMDV毒株特异性抗原位点以及不同拓扑型毒株的序列差异,明确抗原变异的关键氨基酸,可为FMD抗原分子设计提供依据,为FMD防控提供指导。【方法】利用10株(SEA拓扑型)毒株特异性牛源单克隆中和抗体,对毒株O/GSLX/2010(O/Mya/98谱系)进行抗体压力筛选逃逸突变株,鉴定这10株抗体所识别表位的关键氨基酸。利用牛源多抗血清样本(32份)与逃逸突变毒株进行病毒交叉中和试验,分析SEA拓扑型毒株的免疫优势表位;通过序列比对分析不同拓扑型毒株在该抗原表位上的差异。利用反向遗传技术将差异性抗原表位引入O型FMDV经典疫苗株O/HN/CHA/93(Cathay拓扑型),对拯救的点突变毒株测序分析后进行间接免疫荧光试验鉴定,并通过病毒蚀斑测定与一步生长曲线检测病毒的复制动力学。利用SEA拓扑型毒株特异性单克隆中和抗体,通过中和试验分析拯救突变株的抗原性,确定影响病毒抗原性的关键氨基酸,评估毒株特异性位点氨基酸的改变对抗原谱的影响。【结果】SEA拓扑型特异性抗原表位主要集中于结构蛋白VP1的B-C/C-D环,属于抗原位点3。10株抗体中多数抗体(8/10)识别的抗原表位在VP1上,其中有6株单抗(A19、B55、B74、C5、F53和F166)识别的关键氨基酸位于VP1 B-C环(T43、K45)及C-D环(P58),另外2株单抗(B66和F41)识别的关键氨基酸位于VP1 C末端。病毒交叉中和试验结果表明,VP1上43位和VP3上131位氨基酸的改变显著降低了牛源多抗血清的抗体效价。对O型FMDV不同谱系毒株(26株)序列进行分析,发现三种拓扑型毒株VP1 B-C/C-D环的28、47、56和58位氨基酸不同。利用反向遗传技术成功将毒株特异性抗原表位引入Cathay拓扑型毒株(O/HN/CHA/93),拯救出6株FMDV的点突变株:POZ-GSLX-M58、POZ-GSLX-M56/58、POZ-GSLX-M28/58、POZ-GSLX-M47/58、POZ-GSLX-M28/58/47和POZ-GSLX-M47/56/58。微量中和试验结果表明,VP1上56/58位对毒株抗原性起到关键作用;然而,进一步增加28位和47位突变会降低抗体B83的中和作用,影响毒株自身的抗原性。因此,VP1上56和58位氨基酸的改变可以扩展SEA拓扑型特异性中和mAbs对O/HN/CHA/93毒株的中和效力与广度。【结论】O型FMDV结构蛋白VP1上56和58位氨基酸是引起SEA拓扑型毒株抗原变异的关键位点,引入这些抗原决定簇可以拓展FMDV O/HN/CHA/93的抗原谱。研究为FMD防控及疫苗设计提供参考。 展开更多

关键词 口蹄疫病毒 毒株特异性中和抗体 抗原变异

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单细胞转录组学技术及其在寄生虫研究中的应用进展

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作者 周蜓蜓 李立 +5 位作者 吴燕涛 逯文颖 付宝权 殷宏 贾万忠 闫鸿斌 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第10期4290-4301,共12页

单细胞转录组代表了某一时刻单个细胞内所有mRNA总表达量,其表达量反映该细胞的总体特征。通过单细胞转录组测序(single cell RNA sequencing,scRNA-seq)技术对单个细胞的全部RNA进行逆转录、扩增和测序,测序结果中包含的大量信息有可... 单细胞转录组代表了某一时刻单个细胞内所有mRNA总表达量,其表达量反映该细胞的总体特征。通过单细胞转录组测序(single cell RNA sequencing,scRNA-seq)技术对单个细胞的全部RNA进行逆转录、扩增和测序,测序结果中包含的大量信息有可能重塑对发育生物学、基因调控以及健康和疾病中细胞异质性的理解。随着科学技术的不断发展,测序技术也在不断进步,scRNA-seq全方位、高通量以及高分辨率的特点可构建更细致、全面和精准的单细胞图谱。本文综述了常用scRNA-seq方法及其数据分析主要流程和单细胞转录组学技术在寄生虫学与寄生虫病领域研究中的应用,以期为该领域相关研究提供参考资料。 展开更多

关键词 单细胞测序 转录组 数据分析 寄生虫病

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牛病毒性腹泻病毒遗传多样性与防控研究进展

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作者 李志 孟茹 +4 位作者 付永 韩元 尚佑军 高闪电 殷宏 《动物医学进展》 北大核心 2024年第12期106-112,共7页

牛病毒性腹泻(Bovine viral diarrhea)是由黄病毒科瘟病毒属的牛病毒性腹泻病毒(BVDV)感染引起牛的一种传染病,在全球范围内广泛流行,导致严重的经济损失。BVDV可分为BVDV-1、BVDV-2和BVDV-3基因型和众多的基因亚型,宿主范围比较广泛,... 牛病毒性腹泻(Bovine viral diarrhea)是由黄病毒科瘟病毒属的牛病毒性腹泻病毒(BVDV)感染引起牛的一种传染病,在全球范围内广泛流行,导致严重的经济损失。BVDV可分为BVDV-1、BVDV-2和BVDV-3基因型和众多的基因亚型,宿主范围比较广泛,而且可形成持续感染,抑制宿主固有免疫和适应性免疫应答,给防控带来困难。虽然在北欧一些国家利用监测淘汰实现了BVD净化,但在BVD流行率较高的地区,免疫控制策略现实可行。目前我国各地均有BVD报道,基于BVDV-1毒株的灭活疫苗已用于该病的防控,但用于预防多病原引起牛腹泻或牛呼吸道综合征的联合疫苗匮乏,多联多价疫苗的创制将有助于我国BVD防控和净化。 展开更多

关键词 牛病毒性腹泻病毒 基因型与生物型 致病性 免疫抑制作用

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猪瘟与口蹄疫二联疫苗的制备及其免疫效果评价

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作者 高洁 袁红 +12 位作者 焦云娟 李坤 李平花 杨宇轩 黄书伦 郭海洋 邱酉飞 包慧芳 孙普 李冬 刘在新 卢曾军 白兴文 《中国预防兽医学报》 北大核心 2025年第2期172-178,共7页

为研制猪瘟(CSF)与口蹄疫(FMD)二联疫苗并评价其免疫效果,本研究采用真核表达系统瞬时表达猪瘟病毒(CSFV)E2蛋白后经AKTA蛋白纯化仪和Hi Trap TALON纯化柱纯化,采用SDS-PAGE检测重组E2蛋白(r E2)的表达与纯化效果,采用western blot检测r... 为研制猪瘟(CSF)与口蹄疫(FMD)二联疫苗并评价其免疫效果,本研究采用真核表达系统瞬时表达猪瘟病毒(CSFV)E2蛋白后经AKTA蛋白纯化仪和Hi Trap TALON纯化柱纯化,采用SDS-PAGE检测重组E2蛋白(r E2)的表达与纯化效果,采用western blot检测r E2与His-Tag单克隆抗体(MAb)的反应原性。结果显示,在约50 ku处出现目的蛋白条带,纯化后在约50 ku处出现单一条带。western blot结果显示在50 ku处出现特异性条带。表明,r E2获得了表达且纯化效果较好,反应原性较强。将纯化后的r E2与灭活的口蹄疫病毒(FMDV)O/Tibet/99株混合后经ISA 201佐剂乳化制备二联疫苗,将小鼠分为4组:CSFV E2+FMDV(20μg^(+)1μg)组、CSFV E2(20μg)组、FMDV(1μg)组及PBS阴性对照组。于第1 d和21 d分别将相应疫苗以肌肉注射方式免疫6周龄~8周龄的各组雌性BALB/c小鼠,首免后7 d、14 d、21 d、28 d、35 d、42 d采血,利用ELISA检测各组小鼠血清中的抗体水平;利用流式细胞术检测免疫后42 d各组小鼠血液中CD3^(+)/CD4^(+)T淋巴细胞、CD3^(+)/CD8^(+)T淋巴细胞和CD19^(+)B淋巴细胞的占比;采用ELISA检测免疫后42 d各组小鼠血清中IFN-γ的分泌水平。抗体检测结果显示,与PBS组相比,E2组、FMDV组和E2+FMDV组小鼠产生的针对两种病毒的抗体水平均显著和极显著升高(P<0.05、P<0.01、P<0.0001);E2+FMDV组与E2组和FMDV组小鼠血清中CSFV和FMDV的抗体水平均无显著差异(P>0.05)。流式细胞术结果显示,E2组、FMDV组和E2+FMDV组小鼠CD3^(+)/CD4^(+)T淋巴细胞、CD3^(+)/CD8^(+)T淋巴细胞及CD19^(+)B淋巴细胞的占比均显著和极显著高于PBS组(P<0.05、P<0.01、P<0.0001);E2+FMDV组与E2组小鼠上述指标均无显著差异;与FMDV组相比,E2+FMDV组小鼠CD3^(+)/CD4^(+)T淋巴细胞的占比极显著升高(P<0.01),而另外两个指标均无显著差异。ELISA检测结果显示,3个实验组小鼠血清中IFN-γ的分泌水平均显著和极显著高于PBS组(P<0.05、P<0.01),E2+FMDV组与二者单独免疫组小鼠IFN-γ的分泌水平均无显著差异。上述结果表明,E2+FMDV二联疫苗对小鼠的免疫效果与单独免疫E2亚单位疫苗和FMDV灭活疫苗的免疫效果相当,CSFV E2蛋白与FMDV灭活病毒的联合免疫是可行的。综上,本研究首次制备的CSFV E2+FMDV二联苗可作为防控CSF和FMD的一种潜在候选疫苗,为这两种病毒二联甚至多联疫苗的研制奠定了实验基础。 展开更多

关键词 猪瘟 E2蛋白 口蹄疫 二联疫苗

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嵌合流行毒株G-H环基因重组口蹄疫病毒的拯救及其免疫原性分析

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作者 李平花 黄书伦 +11 位作者 张克强 刘锋 孙普 李冬 包慧芳 曹轶梅 白兴文 马雪青 李坤 袁红 刘在新 卢曾军 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第11期5222-5229,共8页

为了研究能有效免疫防控当前流行的O型3个拓扑型口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus,FMDV)的疫苗候选株,本研究利用FMDV反向遗传操作技术,通过基因替换,构建同时含当前流行的O型三个拓扑型病毒株结构蛋白基因的重组全长克隆,转染... 为了研究能有效免疫防控当前流行的O型3个拓扑型口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus,FMDV)的疫苗候选株,本研究利用FMDV反向遗传操作技术,通过基因替换,构建同时含当前流行的O型三个拓扑型病毒株结构蛋白基因的重组全长克隆,转染表达T7RNA聚合酶的细胞后拯救重组FMDV,分析结构蛋白基因的重构对病毒生物学特性的影响;拯救病毒制备灭活疫苗,免疫猪和牛,用体外中和试验初步研究其作为O型FMD疫苗候选株的潜力。结果表明FMD流行毒株结构蛋白VP1 G-H环基因的替换没有明显影响重组病毒的噬斑表型和复制能力,但不同FMDV G-H环抗原表位对猪诱导机体产生交叉中和抗体水平影响较大,对牛诱导机体产生交叉中和抗体的影响较小,表明FMDV G-H抗原表位是猪免疫优势的表位。本研究为未来FMDV疫苗的设计提供了重要参考。 展开更多

关键词 G-H环 重组口蹄疫病毒 拯救 免疫原性分析

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Tollip敲除猪肾细胞系的构建 被引量：1

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作者 王家丽 杨帆 +5 位作者 邵文华 黄梦瑶 曹伟军 蒲秀瑛 张伟 郑海学 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第4期1810-1818,共9页

旨在探究Toll作用蛋白(toll-interacting protein, Tollip)对口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus, FMDV)增殖的影响,利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建Tollip基因缺失的猪肾细胞系(porcine kidney cell line, PK-15),并通过PCR测序... 旨在探究Toll作用蛋白(toll-interacting protein, Tollip)对口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus, FMDV)增殖的影响,利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建Tollip基因缺失的猪肾细胞系(porcine kidney cell line, PK-15),并通过PCR测序和Western blot确认敲除效果,然后利用CCK-8试剂盒测定Tollip缺失后细胞活力变化,确认敲除细胞与野生细胞无显著差异,用FMDV感染敲除细胞后,采用Western blot、间接免疫荧光、实时荧光定量和病毒滴度测定等方法测定病毒在敲除细胞系中复制情况。结果显示:感染FMDV后,敲除细胞与野生细胞相比,显著促进了病毒的复制。综上,在PK-15细胞上,成功构建Tollip缺失细胞系,且试验表明Tollip的缺失有助于FMDV的复制。研究结果为后续Tollip功能研究及抗病毒机制研究提供理论依据。 展开更多

关键词 CRISPR/Cas9 Tollip基因 细胞系 口蹄疫病毒

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非洲猪瘟病毒D1133 L蛋白单克隆抗体抑制其复制 被引量：1

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作者 闫文倩 侯景 +12 位作者 杨金柯 郝雨 杨行 史喜绢 张大俊 别鑫恬 陈国辉 陈玲玲 何路 赵美玉 赵思越 郑海学 张克山 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第2期854-859,共6页

旨在探究非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)D1133L单克隆抗体对病毒复制的调控效应。在制备了ASFV D1133L单克隆抗体的基础上,将ASFV和不同浓度的单克隆抗体同时接种于PAMs,通过红细胞吸附试验(HAD 50)、实时荧光定量PCR(RT... 旨在探究非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)D1133L单克隆抗体对病毒复制的调控效应。在制备了ASFV D1133L单克隆抗体的基础上,将ASFV和不同浓度的单克隆抗体同时接种于PAMs,通过红细胞吸附试验(HAD 50)、实时荧光定量PCR(RT-qPCR)、蛋白质印迹(Western blot)和荧光观察分析D1133L单克隆抗体对病毒复制的影响。结果显示:不同浓度的单克隆抗体在不同的感染时间对ASFV的病毒效价(P<0.01),蛋白表达水平,基因转录水平(P<0.01),ASFV-GFP绿色荧光蛋白的表达水平(P<0.05)均有显著抑制,且这种抑制作用具有剂量依赖性。综上所述,D1133L单克隆抗体可显著抑制ASFV的复制,试验结果在ASFV药物靶点的选择上具有一定的参考意义。 展开更多

关键词 非洲猪瘟病毒 D1133 L蛋白 单克隆抗体

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口蹄疫病毒Asia1型猪源中和抗体的筛选与抗原表位鉴定

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作者 董开恒 黄书伦 +7 位作者 李凤娟 李坤 刘果 张强 包慧芳 李洪炫 卢曾军 张小丽 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第11期5211-5221,共11页

Asia1型口蹄疫病毒(FMDV)仍然在我国周边国家存在,对我国畜牧业造成长期威胁。本研究旨在利用单个B细胞抗体技术研制Asia1型FMDV的中和性单克隆抗体,以此为工具,鉴定Asia1型FMDV的保护性抗原位点。以FMDV Asia1/JS/05为诱饵抗原,通过流... Asia1型口蹄疫病毒(FMDV)仍然在我国周边国家存在,对我国畜牧业造成长期威胁。本研究旨在利用单个B细胞抗体技术研制Asia1型FMDV的中和性单克隆抗体,以此为工具,鉴定Asia1型FMDV的保护性抗原位点。以FMDV Asia1/JS/05为诱饵抗原,通过流式细胞术分选免疫猪PBMCs中的抗原特异性B细胞,通过巢式PCR扩增单个B细胞IgG抗体重链与轻链可变区基因序列,分别构建IgG抗体重链与轻链表达质粒,将其共转染CHO-S细胞进行抗体表达;通过间接ELISA、间接免疫荧光试验(IFA)、病毒中和试验(VNT)验证抗体反应性和中和活性,利用免疫印迹、中和抗体逃逸突变株筛选鉴定中和抗体所识别的抗原表位类型和抗原表位关键氨基酸。结果显示:获得了5株反应性良好的Asia1型FMDV特异性抗体,其中PD3和PD7为中和抗体,两株中和抗体识别相同表位,关键氨基酸为VP2蛋白72位残基(D)。本研究首次获得Asia1型FMDV特异性猪源中和抗体,鉴定VP272D是中和表位的关键氨基酸,进一步丰富了Asia1型FMDV抗原位点信息,为FMDV Asia1型分子疫苗和新诊断检测技术研究的奠定了基础。 展开更多

关键词 口蹄疫病毒 Asia1型 猪源单克隆抗体 抗原表位

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稳定表达猪BRD4-BD1/2蛋白的猪肺泡巨噬细胞传代细胞系的构建及其用于ASFV增殖的效果观察

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作者 吴梦丽 孙华林 +4 位作者 杨吉飞 赵亚茹 关贵全 殷宏 牛庆丽 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第10期4646-4659,共14页

前期研究发现宿主表观遗传调控蛋白——含溴结构域蛋白质4(bromodomain-containing protein 4,BRD4)有助于非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)的复制,为了深入研究BRD4对ASFV复制的影响,通过筛选出显著促进ASFV复制的BRD4-BD... 前期研究发现宿主表观遗传调控蛋白——含溴结构域蛋白质4(bromodomain-containing protein 4,BRD4)有助于非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)的复制,为了深入研究BRD4对ASFV复制的影响,通过筛选出显著促进ASFV复制的BRD4-BD1/2结构域,利用慢病毒表达系统成功构建稳定表达BRD4-BD1/2结构域的3D4/21细胞系,分析ASFV在3D4/21-BRD4-BD1/2细胞系与WT细胞系之间的复制差异。首先,以家猪基因BRD4-BD1/2为靶标,构建了含有3x Flag标签的重组质粒pLVX-IRES-puro-3x Flag-BRD4-BD1/2,并将其与质粒pMD2.G和pSPAX2共同转染至HEK-293T细胞进行慢病毒包装,获得具有感染能力的慢病毒。使用慢病毒感染3D4/21细胞后通过嘌呤霉素药物筛选,成功获得了稳定表达BRD4-BD1/2结构域的3D4/21细胞系。利用RT-qPCR和Western blot技术分别检测了ASFV感染3D4/21-BRD4-BD1/2细胞后CP204L和B602L基因的转录水平以及相应蛋白表达水平,并通过HAD50测定评价ASFV的复制能力。研究结果表明:成功构建了稳定表达BRD4-BD1/2结构域的3D4/21细胞系。与3D4/21-WT细胞系相比,BRD4-BD1/2稳定表达细胞系能够显著促进ASFV复制。本研究提供了深入研究BRD4蛋白在ASFV复制中功能的生物材料,并为ASFV疫苗候选株的开发提供了理论基础。 展开更多

关键词 非洲猪瘟病毒 BRD4 BD1/2 3D4/21细胞 稳定表达细胞系

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信鸽产酸克雷伯菌GS-BY-GG的分离鉴定

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作者 李韦 李赟辉 +5 位作者 金有顺 巴旭丽 张淮瑜 韩涛 李兆才 周继章 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第6期512-519,共8页

目的 分离并鉴定鸽源产酸克雷伯菌,探究其生物学特性及致病性。方法 剖检甘肃某信鸽棚发病鸽,观察并采集病变组织,通过观察病菌形态、生化试验、16S rRNA PCR鉴定和序列分析实现对致病菌的分离鉴定,结合组织病理学观察、药敏试验和致病... 目的 分离并鉴定鸽源产酸克雷伯菌,探究其生物学特性及致病性。方法 剖检甘肃某信鸽棚发病鸽,观察并采集病变组织,通过观察病菌形态、生化试验、16S rRNA PCR鉴定和序列分析实现对致病菌的分离鉴定,结合组织病理学观察、药敏试验和致病性试验对分离菌株进行耐药性和致病性研究。结果 病鸽肝、肺、心等多器官出血,肝脏发黄且质地脆,肺脏发生化脓;从病鸽中成功分离到一株革兰氏阴性、短杆状菌株,麦康凯琼脂培养基上为粉红色光滑、湿润、圆形菌落,靛基质试验阳性;16S rRNA扩增序列与MN330093.1同源性达100.00%,表明病鸽感染产酸克雷伯菌,并命名为GS-BY-GG;产酸克雷伯菌GS-BY-GG对青霉素、氨苄西林和呋喃唑酮等10种药物耐药,对氟苯尼考、美罗培南和庆大霉素等5种药物敏感;组织病理学观察可见病鸽多器官出血,肝脏细胞排列不规则、多处可见棕黄色色素沉积,气管黏膜上皮广泛细胞坏死和脱落、黏膜层可见大量炎性细胞浸润;接种SPF雏鸡显示分离菌具有很强的致病性。结论 本研究成功分离了鸽源产酸克雷伯菌GS-BY-GG,研究结果为产酸克雷伯的临床诊断和防治提供数据支撑。 展开更多

关键词 产酸克雷伯菌 信鸽 分离鉴定 耐药情况 组织病理学

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牛种布鲁氏菌ArsR2蛋白的原核表达及磷酸化位点鉴定

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作者 刘科蒙 耿好 +3 位作者 苏梦茹 许健 支飞杰 储岳峰 《动物医学进展》 北大核心 2024年第9期39-44,共6页

用原核表达系统表达并纯化牛种布鲁氏菌S2308株ArsR2蛋白,软件分析该蛋白相关信息,质谱鉴定该蛋白修饰位点。以牛种布鲁氏菌S2308株基因组为模板,通过PCR扩增arsR2基因,构建pET-32a-ArsR2重组质粒,经测序正确后,转化至大肠埃希氏菌感受... 用原核表达系统表达并纯化牛种布鲁氏菌S2308株ArsR2蛋白,软件分析该蛋白相关信息,质谱鉴定该蛋白修饰位点。以牛种布鲁氏菌S2308株基因组为模板,通过PCR扩增arsR2基因,构建pET-32a-ArsR2重组质粒,经测序正确后,转化至大肠埃希氏菌感受态细胞BL21(DE3)中进行IPTG诱导表达,通过Ni-NTA亲和层析法进行ArsR2蛋白的纯化,并进行SDS-PAGE和Western blot鉴定;对牛种布鲁氏菌ArsR2蛋白的理化性质和磷酸化位点进行预测,通过质谱鉴定ArsR2蛋白的修饰位点。结果显示,成功表达并纯化ArsR2蛋白,ArsR2蛋白无跨膜区,存在磷酸化修饰,质谱鉴定出ArsR2蛋白具有2个磷酸化位点。表明原核表达的牛种布鲁氏菌S2308株ArsR2蛋白存在磷酸化修饰位点,为探究该蛋白的生物学功能奠定了基础。 展开更多

关键词 布鲁氏菌 arsR2基因 原核表达 蛋白纯化

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脯氨酰寡肽酶的研究进展

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作者 王姿逸 茹毅 +5 位作者 卢炳州 杨洋 马坤 冷非凡 郝荣增 郑海学 《中国兽医科学》 北大核心 2025年第2期240-246,共7页

脯氨酰寡肽酶(prolyl oligopeptidase,POP)属于丝氨酸蛋白酶S9家族的成员,能特异性水解多肽链中脯氨酸残基或少数疏水性氨基酸残基的肽键、降解部分多肽类神经递质和激素,具有重要的酶学功能和非酶学活性。近年来,随着对POP结构解析及... 脯氨酰寡肽酶(prolyl oligopeptidase,POP)属于丝氨酸蛋白酶S9家族的成员,能特异性水解多肽链中脯氨酸残基或少数疏水性氨基酸残基的肽键、降解部分多肽类神经递质和激素,具有重要的酶学功能和非酶学活性。近年来,随着对POP结构解析及其功能的研究,证明其在细胞生命周期、代谢、炎症以及自噬等方面均发挥多种重要的生物学功能,可能做为多种疾病的重要治疗靶点。本文主要综述了POP的结构特点、酶学活性和非酶学功能。 展开更多

关键词 脯氨酰寡肽酶 丝氨酸蛋白酶 酶学活性 非酶学功能

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口蹄疫病毒非结构蛋白3D的研究进展

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作者 翟凤格 聂振宇 +3 位作者 张涵 张钊 裴晶晶 郑海学 《中国兽医科学》 北大核心 2025年第2期247-254,共8页

口蹄疫(FMD)是由口蹄疫病毒(FMDV)引起的一种在偶蹄动物间感染与传播的急性、热性、高度传染性疾病,动物死亡率高,严重影响农业生产,造成巨大的经济损失。FMDV 3D^(pol)蛋白不仅在基因组复制中发挥至关重要的作用,还参与调节宿主细胞生... 口蹄疫(FMD)是由口蹄疫病毒(FMDV)引起的一种在偶蹄动物间感染与传播的急性、热性、高度传染性疾病,动物死亡率高,严重影响农业生产,造成巨大的经济损失。FMDV 3D^(pol)蛋白不仅在基因组复制中发挥至关重要的作用,还参与调节宿主细胞生物学过程,包括病毒复制复合体的组装和定位以及先天免疫反应。本文对FMDV 3D^(pol)与宿主的相互作用、抗病毒靶点研究以及病毒检测应用等内容进行了系统综述,旨在为疫病防控提供新思路。 展开更多

关键词 口蹄疫病毒 3D^(pol) 宿主病毒相互作用 药物靶点

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口蹄疫病毒非结构蛋白3A的研究进展 被引量：2

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作者 王家丽 杨帆 +4 位作者 邵文华 黄梦瑶 曹伟军 张伟 郑海学 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2024年第4期441-445,共5页

口蹄疫(FMD)是由口蹄疫病毒(FMDV)引起的一种最具影响、最难控制的动物疫病之一,严重危害着偶蹄动物的健康。FMDV属于单股正链RNA病毒,由结构蛋白和非结构蛋白组成。本文系统总结了口蹄疫病毒非结构蛋白3A的结构和功能特点,有助于进一... 口蹄疫(FMD)是由口蹄疫病毒(FMDV)引起的一种最具影响、最难控制的动物疫病之一,严重危害着偶蹄动物的健康。FMDV属于单股正链RNA病毒,由结构蛋白和非结构蛋白组成。本文系统总结了口蹄疫病毒非结构蛋白3A的结构和功能特点,有助于进一步研究FMDV的感染机制并为FMD防控提供参考。 展开更多

关键词 口蹄疫病毒 非结构蛋白 3A 结构 功能

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2020—2023年甘肃猪繁殖与呼吸综合征病毒的基因遗传变异分析

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作者 焦守德 张婧 +9 位作者 李平花 王健 韩庆彦 张雨星 魏达礼 王方洲 白兴文 卢曾军 马雪青 孙普 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2024年第11期1482-1490,共9页

为了了解甘肃地区猪群中猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的流行及遗传变异情况,采用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法对2020-2023年收集的猪组织样品进行PRRSV ORF5、NSP2和ORF3基因扩增并测序,通过MEGA软件构建遗传进化树进行遗传变异分... 为了了解甘肃地区猪群中猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的流行及遗传变异情况,采用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法对2020-2023年收集的猪组织样品进行PRRSV ORF5、NSP2和ORF3基因扩增并测序,通过MEGA软件构建遗传进化树进行遗传变异分析。结果显示,共检测了52份猪临床样品,PRRSV核酸阳性率为61.5%(32/52),成功获得了32条ORF5、15条NSP2和14条ORF3基因序列。ORF5基因遗传进化分析表明,2020—2023年甘肃地区猪群中PRRSV流行毒株中存在美洲型1.5谱系(4株)、1.8谱系(24株)、5.1谱系(2株)、8.7谱系(2株);NSP2基因遗传进化分析表明,获得的15条NSP2序列均为1.8谱系;ORF3基因遗传进化分析表明,获得的14条ORF3序列包括1.5谱系(2株)、1.8谱系(11株)、3.5谱系(1株)。基因核苷酸序列与参考毒株的同源性分别为ORF582.3%~99.7%、NSP285.9%~90.0%和ORF389.8%~95.7%;基因编码氨基酸序列与参考毒株的同源性分别为ORF579.6%~99.0%、NSP283.4%~87.7%和ORF385.1%~94.5%。ORF5基因编码的GP5蛋白的信号肽区、高变区、细胞表位区等区域均存在不同程度的变异,其中5株毒株的第33位氨基酸出现了缺失;15株NSP2蛋白氨基酸序列的缺失模式与NADC30株一致。上述结果表明,当前甘肃地区猪群中PRRSV呈现以1.8谱系毒株为优势的美洲型多谱系共循环流行,这对甘肃地区防控PRRSV提供了重要的流行病学数据。 展开更多

关键词 猪繁殖与呼吸综合征病毒 ORF5 NSP2 ORF3 遗传变异

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多房棘球绦虫感染的检测方法研究进展

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作者 游杰 李立 +6 位作者 孙继文 詹舒懿 逯文颖 周蜓蜓 殷宏 贾万忠 闫鸿斌 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2024年第7期946-954,共9页

棘球蚴病是由棘球绦虫的幼虫(中绦期)——棘球蚴引起的一类人兽共患寄生虫病。感染棘球绦虫的终末宿主(犬、狐狸等)是传染源,及时准确检测终末宿主感染状况是防控棘球蚴病的关键环节。本文综述了多房棘球绦虫感染的病原学、分子生物学... 棘球蚴病是由棘球绦虫的幼虫(中绦期)——棘球蚴引起的一类人兽共患寄生虫病。感染棘球绦虫的终末宿主(犬、狐狸等)是传染源,及时准确检测终末宿主感染状况是防控棘球蚴病的关键环节。本文综述了多房棘球绦虫感染的病原学、分子生物学和免疫学检测方法的研究进展,以期为终末宿主多房棘球绦虫感染的检测方法研究和试剂盒研发提供指导。 展开更多

关键词 多房棘球绦虫 犬科动物 粪DNA 粪抗原 分子生物学检测 免疫学诊断

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