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大肠埃希菌密度感应调节子qseC基因失活突变株构建及其生物学特性
1
作者 周青帅 赵行行 +5 位作者 李冬梅 崔古贞 陈峥宏 任玮 齐晓岚 洪伟 《实用医学杂志》 CAS 北大核心 2022年第3期288-294,共7页
目的密度感应系统与细菌生长状态、毒力改变、生物膜形成、运动能力改变以及参与细菌和宿主的免疫反应和对药物的抗性等相关。大肠埃希菌密度调节子C(Escherichia coli quorum sensing regulator C,qseC)是其密度感应系统的受体,探究其... 目的密度感应系统与细菌生长状态、毒力改变、生物膜形成、运动能力改变以及参与细菌和宿主的免疫反应和对药物的抗性等相关。大肠埃希菌密度调节子C(Escherichia coli quorum sensing regulator C,qseC)是其密度感应系统的受体,探究其对大肠埃希菌生理、生化特征的影响。方法使用嗜热二型内含子基因打靶系统(Thermotargetron)构建大肠埃希菌HMS174菌株qseC基因失活突变株,测定其生长速率、溶血能力、生物膜形成和运动能力等表型的变化,以及对酸碱和6种抗生素的敏感性。结果成功构建了大肠埃希菌HMS174 qseC627s位点的打靶载体,该载体基因失活效率为100%。对比大肠埃希菌HMS174与ΔqseC627s突变株的表型发现,突变株生长速率和最大生物量降低、溶血能力丧失、生物膜形成能力降低、运动能力减弱、对酸、碱的耐受能力降低。抗生素敏感性测定结果表明,ΔqseC627s对氯霉素、氨苄青霉素、四环素、阿莫西林、甲硝唑耐受性降低。结论大肠埃希菌HMS174中qseC基因缺失后,突变株表型和对抗外界压力因素发生了显著改变。 展开更多
关键词 大肠埃希菌 密度感应系统 Thermotargetron 突变株表型
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鱼腥草内生微生物的分布及其发酵液抑菌活性分析
2
作者 陆秋丹 赵璐 陈峥宏 《贵州农业科学》 2024年第1期74-79,共6页
【目的】探明鱼腥草内生菌的类群组成,筛选对幽门螺杆菌和金黄色葡萄球菌具有抑菌活性的菌株,为进一步开发抗生素类药物先导化合物提供物质基础。【方法】采用组织培养法对贵州地区鱼腥草全植株进行内生菌分离培养和纯化,提取内生菌株... 【目的】探明鱼腥草内生菌的类群组成,筛选对幽门螺杆菌和金黄色葡萄球菌具有抑菌活性的菌株,为进一步开发抗生素类药物先导化合物提供物质基础。【方法】采用组织培养法对贵州地区鱼腥草全植株进行内生菌分离培养和纯化,提取内生菌株基因组DNA,应用PCR技术获得细菌16S rDNA和真菌ITS区扩增产物,经测序并进行BLAST比对确定内生菌属。用摇瓶发酵法制备内生菌发酵液,将发酵液用旋转蒸发仪浓缩,通过24孔板抑菌试验检测发酵液对幽门螺杆菌的抑菌活性;通过打孔法测定抑菌圈直径试验检测发酵液对金黄色葡萄球菌的抑菌活性。【结果】分离到内生细菌60株和内生真菌27株。其中,芽胞杆菌属(Bacillus)和刺盘孢属(Colletotrichum)分别为细菌和真菌的优势菌群,分别占内生细菌和内生真菌的78%和41%。检测到9株内生菌(Kg_(3)、Tg_(23)、Kg_(9)、Tg_(3)、Zg_(3)、Kj_(2)、Ty_(9)、Ty_(2)、Zy_(3))发酵液对幽门螺杆菌有抑菌活性,其中内生菌Kg_(3)发酵液对金黄色葡萄球菌也有抑菌活性。【结论】鱼腥草具有丰富的内生菌资源,其中芽胞杆菌属和刺盘孢属的含量较丰富。 展开更多
关键词 鱼腥草 内生菌 幽门螺杆菌 金黄色葡萄球菌 抗菌活性
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家蝇三龄幼虫Mdctl基因原核表达及生物信息学分析
3
作者 常振策 李忠旬 +3 位作者 贾利娜 修江帆 国果 吴建伟 《贵州医科大学学报》 CAS 2020年第2期145-150,共6页
目的:构建家蝇C型凝集素基因(Mdctl)原核表达体系,对Mdctl基因及编码蛋白进行生物信息学分析。方法:采用生物信息学方法,分析Mdctl基因及编码蛋白;将构建的pET28a(+)/Mdctl重组表达质粒转化至大肠杆菌BL21-DE3中,以异丙基硫代半乳糖苷(I... 目的:构建家蝇C型凝集素基因(Mdctl)原核表达体系,对Mdctl基因及编码蛋白进行生物信息学分析。方法:采用生物信息学方法,分析Mdctl基因及编码蛋白;将构建的pET28a(+)/Mdctl重组表达质粒转化至大肠杆菌BL21-DE3中,以异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达重组蛋白并通过SDS-PAGE对表达产物进行分析;Ni-IDA法纯化重组蛋白,Western-Blot对其鉴定。结果:生物信息学分析显示,Mdctl基因开放阅读框全长333 bp,共编码110个氨基酸,理论分子量为13.13 kDa,等电点为4.49,信号肽位于1~22位氨基酸之间;Mdctl蛋白中存在Clect结构域,属于C型凝集素超家族;Mdctl重组蛋白在大肠杆菌BL21-DE3中主要以包涵体形式表达,重组蛋白的相对分子质量与Mdctl蛋白两端融合6×His标签后的总分子量相一致。结论:成功构建Mdctl原核表达系统,并获得重组蛋白。 展开更多
关键词 家蝇 Mdctl基因 原核表达 蛋白纯化 生物信息学 基因表达
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家蝇 u93基因的原核表达与体外抗菌活性检测 被引量：1
4
作者 马素贞 王涛 +5 位作者 龙慧玲 国果 杨阳 常振策 王兵 吴建伟 《贵州医科大学学报》 CAS 2018年第9期997-1002,共6页
目的:构建家蝇u93基因原核表达体系,检测重组表达产物的体外抗菌活性。方法:采用生物信息学方法,分析u93基因编码蛋白的理化特性;将前期构建的p ET29a-u93重组表达质粒转化至大肠杆菌BL21/DE3中,以异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达重... 目的:构建家蝇u93基因原核表达体系,检测重组表达产物的体外抗菌活性。方法:采用生物信息学方法,分析u93基因编码蛋白的理化特性;将前期构建的p ET29a-u93重组表达质粒转化至大肠杆菌BL21/DE3中,以异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达重组蛋白并通过SDS-PAGE对表达产物进行分析;纯化重组蛋白,采用微量稀释法检测u93重组蛋白的体外抗菌活性。结果:生物信息学分析显示,u93编码基因开放阅读框全长363 bp,共编码120个氨基酸,理论分子量为13. 35 k D,等电点为7. 52,信号肽位于1~20位氨基酸之间;u93重组蛋白在大肠杆菌BL21/DE3中主要以包涵体形式表达,重组蛋白的相对分子质量与理论值相一致; u93重组蛋白对白色念珠菌的最小抑菌浓度(MIC)为21 mg/L、对近平滑念珠菌MIC为12. 5 mg/L、对克柔念珠菌MIC为12. 5 mg/L、对热带念珠菌MIC为12. 5 mg/L,但不能抑制金黄色葡萄球菌及大肠埃希菌的生长繁殖。结论:成功构建u93原核表达系统,重组表达的u93蛋白对念珠菌具有较强的抑杀活性。 展开更多
关键词 家蝇 u93 基因 原核表达 抗菌活性
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基于蛋白质组学技术探讨麻疹减毒活疫苗191株抑制三阴性乳腺癌细胞增殖的可能机制 被引量：2
5
作者 姚梦玮 李玉迁 +4 位作者 徐庆胜 方小菡 魏洪 迟茜文 刘蕊 《中国肿瘤生物治疗杂志》 CAS CSCD 北大核心 2023年第7期568-576,共9页
目的:基于蛋白质组学技术探讨麻疹减毒活疫苗191株(MV-Hu191)在体内外对三阴性乳腺癌MDA-MB-231、4T1细胞的影响及其作用机制。方法:采用CCK-8法检测MV-Hu191对MDA-MB-231和4T1细胞增殖的影响;液相色谱-质谱联用技术分析MV-Hu191处理对M... 目的:基于蛋白质组学技术探讨麻疹减毒活疫苗191株(MV-Hu191)在体内外对三阴性乳腺癌MDA-MB-231、4T1细胞的影响及其作用机制。方法:采用CCK-8法检测MV-Hu191对MDA-MB-231和4T1细胞增殖的影响;液相色谱-质谱联用技术分析MV-Hu191处理对MDA-MB-231细胞中蛋白质谱的影响,多重数据库筛选蛋白质谱中的典型差异蛋白质并进行GO、KEGG、亚细胞定位与功能注释。瘤内注射1×106 TCID50 MV-Hu191干预4T1细胞移植瘤模型小鼠,流式细胞术检测小鼠脾组织中T细胞亚群,ELISA法检测小鼠血清TNF-α和IL-6含量。结果:体外实验结果表明,MV-Hu191具有抑制MDA-MB-231和4T1细胞增殖的作用,差异均具有统计学意义(P<0.01)。蛋白质组学分析结果显示,MV-Hu191作用MDA-MB-231细胞后明显上调蛋白质有38个、下调有12个;差异表达的蛋白质主要参与细胞黏附、信号受体激活、细胞代谢、应激反应等生物学过程,22个差异蛋白质亚细胞定位位于细胞外,KEGG功能分类显示与免疫调节功能相关的差异蛋白质最多且均为上调蛋白,包括C4A、C8B、SERPINF2、A2M、SERPINC1、CTSB、SERPING1、C5;PPI预测发现免疫相关差异蛋白与CD4、CD8、TNF-α及IL-6相互关联。体内实验结果显示,MV-Hu191干预组小鼠脾组织中CD4+T细胞数量略高于对照组,但差异无统计学意义(P>0.05),CD4+/CD8+T细胞比值明显高于对照组(P<0.05),血清TNF-α和IL-6含量显著上升(均P<0.01)。结论:MV-Hu191显著抑制MDA-MB-231、4T1细胞增殖及拮抗4T1细胞荷瘤小鼠成瘤性,其机制可能是MV-Hu191通过激活免疫效应分子实现抗肿瘤作用。 展开更多
关键词 麻疹溶瘤病毒 MV-Hu191 三阴性乳腺癌 MDA-MB-231细胞 4T1细胞 细胞增殖 蛋白质组学
原文传递
家蝇u93基因编码蛋白多克隆抗体的制备与鉴定
6
作者 马素贞 王涛 +5 位作者 龙慧玲 国果 杨阳 常振策 王兵 吴建伟 《贵州医科大学学报》 CAS 2018年第9期993-996,共4页
目的:制备特异性的u93基因编码蛋白的多克隆抗体。方法:采用原核表达技术,体外诱导表达u93重组蛋白;采用蛋白免疫法,以纯化的重组蛋白为抗原免疫新西兰大白兔获得多克隆抗体;用ELISA法检测多克隆抗体效价,运用Western-blot方法对u93多... 目的:制备特异性的u93基因编码蛋白的多克隆抗体。方法:采用原核表达技术,体外诱导表达u93重组蛋白;采用蛋白免疫法,以纯化的重组蛋白为抗原免疫新西兰大白兔获得多克隆抗体;用ELISA法检测多克隆抗体效价,运用Western-blot方法对u93多克隆抗体的纯度和特异性进行分析。结果:制备的兔抗u93重组蛋白多克隆抗体效价为1∶4 000,Western-blot结果显示该多克隆抗体能特异性识别u93重组蛋白。结论:成功制备u93基因编码蛋白的多克隆抗体。 展开更多
关键词 家蝇 u93 基因 重组蛋白 原核表达 多克隆抗体
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家蝇三龄幼虫Clip-Msp基因克隆及白假丝酵母菌刺激下的时空表达
7
作者 常振策 李忠旬 +4 位作者 修江帆 卢成 贾利娜 国果 吴建伟 《贵州医科大学学报》 CAS 2020年第2期138-144,共7页
目的:克隆家蝇的Clip-丝氨酸蛋白酶基因(Clip-Msp),并对Clip-Msp在白假丝酵母菌感染后的时空表达模式进行研究。方法:通过基因工程的方法,构建pMD19-T/Clip-Msp克隆载体;采用生物信息学方法,分析Clip-Msp基因的开放阅读框和氨基酸序列及... 目的:克隆家蝇的Clip-丝氨酸蛋白酶基因(Clip-Msp),并对Clip-Msp在白假丝酵母菌感染后的时空表达模式进行研究。方法:通过基因工程的方法,构建pMD19-T/Clip-Msp克隆载体;采用生物信息学方法,分析Clip-Msp基因的开放阅读框和氨基酸序列及Clip-Msp蛋白的功能结构域;以GAPDH作为内参照,于家蝇三龄幼虫感染白假丝酵母菌后3、12、24及48 h时,采用实时荧光定量PCR方法检测Clip-Msp在不同组织(体壁、脂肪体、血淋巴、唾液腺、肠道、马氏管和气管)中的表达情况。结果:成功构建pMD19-T/Clip-Msp克隆载体,生物信息学分析显示,Clip-Msp基因开放阅读框全长1524 bp,共编码507个氨基酸、无信号肽、存在跨膜区,属于非经典分泌型蛋白;Clip-Msp蛋白的N端存在一个Clip结构域,C端有一个Tryp_SPc催化结构域,属于单催化结构域Clip-丝氨酸蛋白酶超家族;白假丝酵母菌感染家蝇三龄幼虫后,Clip-Msp基因在不同时间点、不同组织中表达存在差异(P<0.05),3 h时以血淋巴中表达量增加最高,12 h时以脂肪体、气管、唾液腺及肠道中表达量增加为主、脂肪体内的相对表达量最高,24 h时肠道组织表达增加最明显、脂肪体次之,48 h时血淋巴中表达量高于马氏管及肠道。结论:成功克隆Clip-Msp基因,Clip-Msp基因主要分布在血淋巴、脂肪体和肠道组织。 展开更多
关键词 家蝇 Clip-Msp基因 白假丝酵母菌 基因表达 感染 生物信息学
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斑马鱼结核性脑膜炎模型的制备及其用于抗结核性脑膜炎药物评价的研究
8
作者 刘茂颖 牛良飞 +4 位作者 郭文娟 郭晓奎 宋曙 晏博 陈峥宏 《贵州医科大学学报》 2025年第4期502-512,共11页
目的制备两种不同的斑马鱼-海分枝杆菌(Mycobacterium marinum,M.m)结核性脑膜炎模型,评价抗结核药物穿过血脑屏障清除斑马鱼脑部细菌的能力,评估模型应用于抗结脑药物评价的可行性。方法以斑马鱼幼鱼为观察对象,显微注射M.m至斑马鱼幼... 目的制备两种不同的斑马鱼-海分枝杆菌(Mycobacterium marinum,M.m)结核性脑膜炎模型,评价抗结核药物穿过血脑屏障清除斑马鱼脑部细菌的能力,评估模型应用于抗结脑药物评价的可行性。方法以斑马鱼幼鱼为观察对象,显微注射M.m至斑马鱼幼鱼总主静脉与后脑,制备全身性与局限性感染的结核性脑膜炎模型;通过高内涵显微镜拍摄斑马鱼体内M.m的动态变化,同时利用抗酸染色、HE染色评估两种模型的制备效果;体外测试异烟肼(isoniazid,INH)、利福平(rifampicin,RIF)对M.m菌株的最小抑菌浓度(minimal inhibitory concentration,MIC);用不同剂量的INH、RIF以总主静脉注射或浸泡给药的方式处理脑部局部感染的斑马鱼幼鱼,通过检测药物作用后斑马鱼脑部菌载量,评价药物穿过血脑屏障对脑部M.m生长的作用。结果经总主静脉注射,M.m可随血液循环生长扩散至斑马鱼幼鱼脑部,可模拟肺外(mycobacterium tuberculosis,Mtb)随血液循环系统进入脑部的感染过程;后脑注射M.m可在斑马鱼脑部引发类上皮细胞增生、炎症细胞聚集等免疫反应,并且在感染后4 d,M.m仍局限在斑马鱼脑部,此种感染方式适用于研究药物入脑的效果;INH对抑制脑部M.m生长的效果优于RIF(P<0.05),提示INH能更好的穿透血脑屏障发挥功效。结论通过总主静脉、后脑注射M.m至斑马鱼幼鱼可成功制备斑马鱼结核性脑膜炎模型,该模型可用于评估抗结核药物通过血脑屏障的能力。 展开更多
关键词 斑马鱼 海分枝杆菌 结核性脑膜炎模型 异烟肼 利福平
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艰难拟梭菌PaLoc致病决定区基因座敲除突变株转录组学分析及其减毒验证
9
作者 崔古贞 周青帅 +10 位作者 程钦全 饶凤琴 程玉梅 田艳 张婷 陈峥宏 廖健 官志忠 齐晓岚 吴棋 洪伟 《中华预防医学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2022年第5期601-608,共8页
目的对艰难拟梭菌630(Cd630)菌株和致病决定区基因座(PaLoc)敲除突变株(ΔPaLoc)进行转录组测序和分析,获得Cd630野生型菌株和ΔPaLoc基因的差异性表达谱,并测定野生型Cd630菌株和ΔPaLoc突变株的细胞毒力,为构建艰难拟梭菌全菌减毒疫... 目的对艰难拟梭菌630(Cd630)菌株和致病决定区基因座(PaLoc)敲除突变株(ΔPaLoc)进行转录组测序和分析,获得Cd630野生型菌株和ΔPaLoc基因的差异性表达谱,并测定野生型Cd630菌株和ΔPaLoc突变株的细胞毒力,为构建艰难拟梭菌全菌减毒疫苗奠定基础。方法对Cd630菌株和ΔPaLoc敲除突变株进行转录组测序,接着对差异表达基因进行筛选,随后对差异基因进行基因本体(GO)和京都基因与基因组百科全书(KEGG)富集分析。最后在非洲绿猴肾细胞(Vero)和人克隆结肠腺癌细胞株(Caco-2)中进行Cd630野生型菌株和ΔPaLoc敲除突变菌株的细胞毒性验证实验。结果转录组数据表明ΔPaLoc突变株毒素基因tcdA、tcdB未转录。CD630_36010、CD630_020910、CD630_02080和cel等基因分别上调17.92、11.40、8.93和7.55倍;编码高丝氨酸脱氢酶的hom2基因、孢子形成蛋白基因CD630_15810、锌结合脱氢酶基因CD630_23230、1-磷酸半乳糖醇5-脱氢酶基因CD630_23240分别下调为野生型的0.06、0.075、0.133和0.183倍。GO和KEGG富集分析结果表明,ΔPaLoc突变株差异转录基因主要富集于密度感应系统、ABC运输系统、双组分系统、磷酸转移酶(PTS)系统、糖代谢通路以及万古霉素耐药相关的通路等。细胞毒力实验结果表明野生型Cd630菌株对Vero细胞和Caco-2细胞具有毒力,ΔPaLoc突变株丧失对Vero细胞和Caco-2细胞的毒力。结论通过对Cd630和ΔPaLoc突变株进行转录测序,表明毒素基因未转录,其他差异性基因可为进一步研究ΔPaLoc突变株生理生化特征提供指引。细胞毒力实验表明,ΔPaLoc突变株丧失了对Vero细胞和Caco-2细胞的毒力,ΔPaLoc突变株为艰难拟梭菌全菌减毒疫苗的构建奠定了基础。 展开更多
关键词 基因敲除技术 规律间隔成簇短回文重复序列 细菌毒素 艰难拟梭菌 减毒突变体
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