多星韭AwCHI 1的克隆与分析及真核表达载体的构建

1

作者 赵鑫 张艳 +3 位作者 肖松 黄菊 陈瑶 孙威 《贵州师范大学学报（自然科学版）》 CAS 北大核心 2024年第2期118-126,共9页

查尔酮异构酶(Chalcone isomerase,CHI)是类黄酮物质合成途径中的关键酶,能催化柚皮素查尔酮生成柚皮素,进而转化生成各种类型的黄酮类化合物。根据多星韭(Allium wullichii)转录组测序结果,运用PCR技术克隆获取多星韭查尔酮异构酶的编... 查尔酮异构酶(Chalcone isomerase,CHI)是类黄酮物质合成途径中的关键酶,能催化柚皮素查尔酮生成柚皮素,进而转化生成各种类型的黄酮类化合物。根据多星韭(Allium wullichii)转录组测序结果,运用PCR技术克隆获取多星韭查尔酮异构酶的编码基因(AwCHI 1),对基因序列进行分析,同时与真核表达载体pBI121进行连接,将其转入农杆菌GV3101感受态细胞中,完成农杆菌的转化。研究结果不仅为该基因的功能解析研究奠定了基础,也为多星韭类黄酮代谢途径的研究提供了重要基因资源。 展开更多

关键词 类黄酮 查尔酮异构酶 多星韭 真核表达载体

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马缨杜鹃查尔酮异构酶(RdCHI1)重组蛋白的制备及功能验证

2

作者 王聿晗 孙世宇 +2 位作者 鞠志刚 孙威 徐小蓉 《福建农业学报》 CAS CSCD 北大核心 2023年第5期574-582,共9页

【目的】制备马缨杜鹃(Rhododendron delavayi)查尔酮异构酶(Chalcone isomerase,CHI)基因表达的重组蛋白并验证其活性,为解析查尔酮异构酶功能提供理论依据,为改良植物花色、增加药用成分奠定基础。【方法】根据所获得的马缨杜鹃查尔... 【目的】制备马缨杜鹃(Rhododendron delavayi)查尔酮异构酶(Chalcone isomerase,CHI)基因表达的重组蛋白并验证其活性,为解析查尔酮异构酶功能提供理论依据,为改良植物花色、增加药用成分奠定基础。【方法】根据所获得的马缨杜鹃查尔酮异构酶RdCHI1基因的序列信息设计引物,构建其原核表达载体,优化RdCHI1可溶性重组蛋白最佳诱导表达条件,制备可溶性重组蛋白并检测其活性。【结果】成功构建RdCHI1原核表达载体,RdCHI1重组蛋白可在上清中表达,最佳诱导条件为:15℃、36 h,IPTG浓度0.35 mmol·L^(-1)。经镍柱纯化得到质量较好的RdCHI1重组蛋白,通过体外酶活反应确定,与对照组相比,RdCHI1可以更快地催化柚皮素查尔酮(Naringenin chalcone)反应生成柚皮素(Naringenin)。【结论】RdCHI1为I型CHI,可极大提高柚皮素查尔酮生成柚皮素的速率,增加黄酮类物质积累量。 展开更多

关键词 马缨杜鹃 查尔酮异构酶 原核表达载体 可溶性重组蛋白 酶活测定

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日本蛇根草OjDFR5基因的克隆与真核表达载体的构建

3

作者 王聿晗 张艳 +2 位作者 黄菊 徐小蓉 孙威 《贵州师范大学学报（自然科学版）》 CAS 2023年第2期62-67,共6页

二氢黄酮醇4-还原酶具有明显的底物特异性,是类黄酮代谢途径中的关键酶,对不同花青素的合成与积累起到决定作用,直接影响植物的颜色性状。日本蛇根草是一种具有较好药用价值的研究材料。通过分子生物学方法克隆获得日本蛇根草中的二氢... 二氢黄酮醇4-还原酶具有明显的底物特异性,是类黄酮代谢途径中的关键酶,对不同花青素的合成与积累起到决定作用,直接影响植物的颜色性状。日本蛇根草是一种具有较好药用价值的研究材料。通过分子生物学方法克隆获得日本蛇根草中的二氢黄酮醇4-还原酶的编码基因,OjDFR5,并对该基因的序列进行分析,同时将其与真核表达载体pBI121进行连接,获得真核重组表达质粒pBI121-OjDFR5,并将重组质粒转入农杆菌GV3101感受态细胞中。研究结果一方面为该基因的功能解析奠定基础,同时也为探究日本蛇根草类黄酮代谢机制研究提供基因资源。 展开更多

关键词 二氢黄酮醇4-还原酶 日本蛇根草 OjDFR5 基因克隆 真核表达载体

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马缨杜鹃RdDFR1基因的克隆分析与可溶性重组蛋白的制备

4

作者 王聿晗 陈瑶 +2 位作者 黄菊 徐小蓉 孙威 《贵州师范大学学报（自然科学版）》 CAS 2023年第4期88-96,共9页

二氢黄酮醇4-还原酶位于类黄酮代谢途径下游,可催化二氢黄酮醇转化为对应的花色素苷,因具有底物特异性,直接影响植物颜色的呈现。通过PCR法克隆得到马缨杜鹃DFR1基因(RdDFR1),序列分析显示,RdDFR1不具有信号肽,定位在细胞质膜的可能性最... 二氢黄酮醇4-还原酶位于类黄酮代谢途径下游,可催化二氢黄酮醇转化为对应的花色素苷,因具有底物特异性,直接影响植物颜色的呈现。通过PCR法克隆得到马缨杜鹃DFR1基因(RdDFR1),序列分析显示,RdDFR1不具有信号肽,定位在细胞质膜的可能性最大,与越桔DFR的亲缘关系最近。随后,将RdDFR1与原核表达载体pET-32a(+)连接,构建重组质粒pET-32a(+)-RdDFR1,并转入大肠杆菌BL21感受态细胞中。诱导表达分析显示,重组蛋白最佳诱导表达条件为:IPTG浓度为0.25 mmol/L,15℃下诱导48 h。按照上述条件制备并纯化得到了符合实验要求的重组蛋白,为研究RdDFR1的生物学功能及性质奠定了基础。 展开更多

关键词 二氢黄酮醇4-还原酶 马缨杜鹃 基因克隆 蛋白制备

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马缨杜鹃Actin基因片段的克隆及序列分析 被引量：1

5

作者 孙威 林建 +3 位作者 申欢 李欲轲 马玲 乙引 《贵州师范大学学报（自然科学版）》 CAS 2018年第5期69-73,78,共6页

为研究马缨杜鹃相关功能基因的表达模式提供内参基因,本研究根据Gen Bank中公布的锦绣杜鹃肌动蛋白基因(Actin)的保守序列设计引物,以马缨杜鹃c DNA为模板,利用RT-PCR方法克隆得到马缨杜鹃Actin基因部分c DNA片段,将其命名为Rd Actin。... 为研究马缨杜鹃相关功能基因的表达模式提供内参基因,本研究根据Gen Bank中公布的锦绣杜鹃肌动蛋白基因(Actin)的保守序列设计引物,以马缨杜鹃c DNA为模板,利用RT-PCR方法克隆得到马缨杜鹃Actin基因部分c DNA片段,将其命名为Rd Actin。结果显示:该基因片段长度为468 bp,编码156个氨基酸;保守域分析表明该基因具有Actin的功能保守域,同时Rd Actin与其它植物Actin的氨基酸序列同源性达97%以上。 展开更多

关键词 马缨杜鹃 ACTIN基因 基因克隆 序列分析

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日本蛇根草Actin基因片段的克隆及其序列分析

6

作者 孙威 徐僡 +4 位作者 林建 马玲 申欢 李欲轲 乙引 《贵州师范大学学报（自然科学版）》 CAS 2018年第6期38-42,67,共6页

为研究日本蛇根草功能基因的表达提供内参基因,笔者参照GenBank中桔梗的肌动蛋白基因(Actin)序列设计引物,以日本蛇根草的cDNA为模板,通过RT-PCR方法成功克隆获得日本蛇根草Actin基因片段,并将其命名为OjActin(OjActin片段长469 bp)。... 为研究日本蛇根草功能基因的表达提供内参基因,笔者参照GenBank中桔梗的肌动蛋白基因(Actin)序列设计引物,以日本蛇根草的cDNA为模板,通过RT-PCR方法成功克隆获得日本蛇根草Actin基因片段,并将其命名为OjActin(OjActin片段长469 bp)。功能保守域分析显示OjActin归属于Actin超家族,与其他植物Actin的氨基酸序列同源性达94%以上;系统进化树分析显示,OjActin与咖啡的亲缘关系最近。 展开更多

关键词 日本蛇根草 ACTIN 基因 基因克隆 序列分析

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高纯度金钗石斛生物碱提取工艺的开发 被引量：3

7

作者 张丽君 李菲 +2 位作者 洪鲲 张宇斌 乙引 《贵州师范大学学报（自然科学版）》 CAS 2021年第1期30-35,共6页

通过设置不同pH、温度、酶解时间、酶用量和乙醇浓度等梯度条件,确定酶法提取生物碱的最适条件为酶用量7 mg酶/g石斛粉、缓冲液pH=5、酶解温度40℃、酶解时间2 h;提取条件在75%的乙醇、固液比为1∶12,碱化后在pH=8时,效果最好。将乙醚... 通过设置不同pH、温度、酶解时间、酶用量和乙醇浓度等梯度条件,确定酶法提取生物碱的最适条件为酶用量7 mg酶/g石斛粉、缓冲液pH=5、酶解温度40℃、酶解时间2 h;提取条件在75%的乙醇、固液比为1∶12,碱化后在pH=8时,效果最好。将乙醚重结晶3次母液合并,以20 kg石斛作为原料,可获得20 g以上纯度为98.4%的产物,经气质联用法(GC-MS)鉴定提取物为石斛碱。结论:酶法提取生物碱的效果较好,可用于金钗石斛总生物碱的分离纯化。该方法简单快速,稳定高效,具有潜在工业生产价值,为金钗石斛总生物碱的工业化生产提供了实验依据。 展开更多

关键词 金钗石斛 石斛碱 酶法提取 纯化回收

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日本蛇根草DFR3基因的克隆分析及其编码蛋白的分离纯化 被引量：3

8

作者 冯猜 周娜娜 +2 位作者 孙世宇 周洁羽 孙威 《西北植物学报》 CAS CSCD 北大核心 2021年第6期926-932,共7页

二氢黄酮醇4-还原酶(DFR)作为花色苷代谢途径下游的关键酶,对植物花色苷的合成具有重要调控作用。该研究以日本蛇根草(Ophiorrhiza japonica)为材料,采用RT-PCR方法克隆获得一个DFR基因(OjDFR3),利用生物信息学方法对OjDFR3蛋白的性质... 二氢黄酮醇4-还原酶(DFR)作为花色苷代谢途径下游的关键酶,对植物花色苷的合成具有重要调控作用。该研究以日本蛇根草(Ophiorrhiza japonica)为材料,采用RT-PCR方法克隆获得一个DFR基因(OjDFR3),利用生物信息学方法对OjDFR3蛋白的性质进行了分析,通过实验完成该基因原核表达载体的构建及其重组蛋白的制备与纯化,为深入揭示日本蛇根草DFR基因的功能以及花色苷的合成与调控研究奠定基础。结果表明:(1)成功克隆获得一个DFR基因(OjDFR3);序列分析显示,OjDFR3基因cDNA全长为1071 bp,可编码356个氨基酸,蛋白分子量为39.52 kD。(2)生物信息学分析表明,OjDFR3基因编码形成的蛋白由20种氨基酸组成,其中亮氨酸含量最多,不存在信号肽,是一种亲水性蛋白,定位在细胞质的可能性最大,三级结构由α螺旋、延伸链、无规则卷曲组成。(3)原核表达分析显示,重组质粒pET32a-OjDFR3可在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,其最佳诱导表达条件为37℃、4 h、IPTG浓度为0.8 mmol/L,同时在100和200 mmol/L咪唑洗脱下的蛋白纯度最好。(4)按照上述最佳条件,制备并获得了大量浓度和纯度较好的蛋白。 展开更多

关键词 日本蛇根草 二氢黄酮醇4-还原酶 基因克隆 重组蛋白表达与纯化

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铁皮石斛花青素合成酶基因的生物信息学分析 被引量：2

9

作者 周娜娜 冯猜 +1 位作者 徐僡 孙威 《贵州师范大学学报（自然科学版）》 CAS 2021年第1期36-40,94,共6页

花青素合成酶(ANS)是花青素合成途经中的关键酶,可催化无色花色素转变成有色花色素。本文从NCBI数据库中获取铁皮石斛花青素合成酶基因(DoANS)的cDNA序列,并利用生物信息学方法对该基因进行了分析。分析结果表明:该基因完整的开放阅读框... 花青素合成酶(ANS)是花青素合成途经中的关键酶,可催化无色花色素转变成有色花色素。本文从NCBI数据库中获取铁皮石斛花青素合成酶基因(DoANS)的cDNA序列,并利用生物信息学方法对该基因进行了分析。分析结果表明:该基因完整的开放阅读框长1077 bp,共编码358个氨基酸,其中亮氨酸含量最高,占氨基酸总数的10.9%,半胱氨酸含量最低,占氨基酸总数的1.1%。理化性质分析表明,DoANS蛋白分子质量为39.59 kD,属于亲水性蛋白,理论等电点为5.42,无信号肽,主要分布于细胞质中;二级结构中无规则卷曲占比59.78%,延伸链占比15.08%,同时蛋白三级结构分析结果与之相符。最后,系统进化分析显示,DoANS与大花惠兰ANS的亲缘关系最近。 展开更多

关键词 铁皮石斛 花青素合成酶基因 生物信息学

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OjCHI真核表达载体的构建及农杆菌的遗传转化 被引量：1

10

作者 徐僡 高方平 +2 位作者 郑远静 周娜娜 孙威 《贵州师范大学学报（自然科学版）》 CAS 2020年第5期29-34,共6页

查尔酮异构酶(Chalcone isomerase,CHI)是类黄酮生物合成途径中的第二个关键酶,在类黄酮合成与积累过程中发挥着至关重要的作用。笔者以日本蛇根草为材料,在克隆获得其CHI基因(OjCHI)的基础上,将该基因插入由35S启动子控制的真核表达载... 查尔酮异构酶(Chalcone isomerase,CHI)是类黄酮生物合成途径中的第二个关键酶,在类黄酮合成与积累过程中发挥着至关重要的作用。笔者以日本蛇根草为材料,在克隆获得其CHI基因(OjCHI)的基础上,将该基因插入由35S启动子控制的真核表达载体pBI121,完成重组表达质粒pBI121-OjCHI的构建,同时利用冻融法将重组质粒成功转入农杆菌GV3101。该实验的完成可为下一步通过转基因技术研究该基因的功能奠定基础。 展开更多

关键词 日本蛇根草 查尔酮异构酶基因 真核表达载体 遗传转化

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金钗石斛查尔酮合酶基因的生物信息学分析 被引量：1

11

作者 徐僡 高方平 +2 位作者 郑远静 周娜娜 孙威 《贵州师范大学学报（自然科学版）》 CAS 2020年第4期64-68,118,共6页

利用生物信息学工具及方法对金钗石斛查尔酮合成酶基因进行分析。结果显示,金钗石斛查尔酮合酶基因(DnCHS)完整的CDS为1 188 bp,共编码395个氨基酸,蛋白分子量为43.10 kD,理论等电点为6.22,且该蛋白为亲水性蛋白,不存在信号肽,很可能定... 利用生物信息学工具及方法对金钗石斛查尔酮合成酶基因进行分析。结果显示,金钗石斛查尔酮合酶基因(DnCHS)完整的CDS为1 188 bp,共编码395个氨基酸,蛋白分子量为43.10 kD,理论等电点为6.22,且该蛋白为亲水性蛋白,不存在信号肽,很可能定位在细胞质中。同时,蛋白质二级和三级结构的分析表明,DnCHS蛋白由33.92%的α螺旋,8.35%的延伸链以及57.72%的无规则卷曲组成。系统进化分析显示,DnCHS与红掌的亲缘关系最近。 展开更多

关键词 金钗石斛 查尔酮合酶 生物信息学

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锦绣杜鹃类黄酮-3′,5′-羟基化酶基因的生物信息学分析

12

作者 孙世宇 冯猜 +1 位作者 孙威 徐小蓉 《贵州师范大学学报（自然科学版）》 CAS 2022年第3期33-38,55,共7页

类黄酮-3′,5′-羟基化酶(Flavonoid 3′,5′-hydroxylase,F3′5′H)是类黄酮代谢途径的一个关键酶,能使花色素的合成方向趋向于蓝色的飞燕草素。利用生物信息学软件对锦绣杜鹃类黄酮-3′,5′-羟基化酶基因(RpF3′5′H)进行分析。结果显... 类黄酮-3′,5′-羟基化酶(Flavonoid 3′,5′-hydroxylase,F3′5′H)是类黄酮代谢途径的一个关键酶,能使花色素的合成方向趋向于蓝色的飞燕草素。利用生物信息学软件对锦绣杜鹃类黄酮-3′,5′-羟基化酶基因(RpF3′5′H)进行分析。结果显示,RpF3′5′H基因ORF长1551 bp,共编码516个氨基酸;分子量为57.31 kD,等电点为9.03,无信号肽,定位于细胞质中的可能性最大,二级结构与三级结构中含有较多的α螺旋,与高丛越橘有较高亲缘性。分析结果将对RpF3′5′H的功能解析奠定理论基础,同时也为探究锦绣杜鹃花色苷的生物合成有一定指导作用。 展开更多

关键词 锦绣杜鹃 类黄酮-3′5′-羟基化酶 生物信息学分析

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DNA分类和形态分类共同界定一只草海死亡鸟类残体

13

作者 王野影 孙喜娇 +2 位作者 熊勇 张明明 粟海军 《黑龙江畜牧兽医》 CAS 北大核心 2018年第15期184-187,244,共5页

为了对来自贵州草海国家级自然保护区的鸭头残体进行界定,试验利用鸟羽、鸟喙、鸟爪等相关特点,结合获取细胞色素C氧化酶亚单位Ⅰ（COⅠ）基因的BLAST结果,选择相似度高的序列,构建了基于COⅠ部分序列的鸭属鸟类的系统发育树。结果表明... 为了对来自贵州草海国家级自然保护区的鸭头残体进行界定,试验利用鸟羽、鸟喙、鸟爪等相关特点,结合获取细胞色素C氧化酶亚单位Ⅰ（COⅠ）基因的BLAST结果,选择相似度高的序列,构建了基于COⅠ部分序列的鸭属鸟类的系统发育树。结果表明：在形态学上,此鸭头与绿翅鸭最接近;分子系统进化树中显示,此鸭头为新种或新亚种,未与绿翅鸭聚为一支,需要通过获取草海绿翅鸭的COⅠ基因进行进一步确认。死亡鸟类是非常宝贵的资源,通过对死亡鸟类利用价值的讨论,引起业界人士对野生死亡动物的关注,进而可以对其进行妥善的处理和利用。提示在未来的野生动物保护与管理中,应注重基因组测序技术、分子疾病诊断技术等先进的分子生物学技术的应用。 展开更多

关键词 野生鸟类 死亡残体 鉴定 DNA分类 形态学分类

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