基于噬菌体展示技术醛固酮特异性抗体的筛选

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作者 王素娟 田晓平 +1 位作者 赵巧辉 王天云 《新乡医学院学报》 CAS 2024年第3期214-220,共7页

目的利用噬菌体展示技术及重组抗体构建技术筛选出特异性醛固酮(ALD)抗体,为ALD诊断试剂盒的研发提供原材料。方法取5只健康清洁级新西兰大白兔,将抗原ALD-血蓝蛋白(KLH)稀释至2 mg·L^(-1),采用背部多点注射方法对5只新西兰大白兔... 目的利用噬菌体展示技术及重组抗体构建技术筛选出特异性醛固酮(ALD)抗体,为ALD诊断试剂盒的研发提供原材料。方法取5只健康清洁级新西兰大白兔,将抗原ALD-血蓝蛋白(KLH)稀释至2 mg·L^(-1),采用背部多点注射方法对5只新西兰大白兔进行首次免疫,免疫剂量为每只1 mg;每隔2周进行1次免疫,且免疫剂量减少50%;从第3次免疫开始,每次免疫1周后采集大白兔耳缘静脉血,使用包被0.25 mg·L^(-1) ALD-BSA抗原的化学发光板,采用间接法和竞争法测定血清滴度;第5次免疫后选取血清效价高、特异性好的大白兔,取其脾脏和骨髓等组织。将脾脏组织研磨,采用TRIzol试剂一步法提取RNA,获取轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)基因序列。通过连接肽连接成单链片段(ScFv)并构建至噬菌粒载体Pcomb3xss中;然后,通过电转化方法将其导入大肠杆菌TG1,完成ALD ScFv噬菌体展示库构建。对文库进行3~5轮富集筛选,并挑取单克隆进行噬菌体上清制备,应用酶联免疫吸附试验(ELISA)竞争法鉴定后送测,获得高竞争性克隆序列;将筛选得到的克隆序列插入至pCMV3表达载体,提取质粒后使用瞬时转染方法进行HEK293细胞转染;1周后,收取上清,应用亲和层析纯化及十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)电泳鉴定其纯度及表达量。结果5只大白兔在第5次免疫后,间接法检测其血清效价结果显示,4#、5#大白兔血清在稀释32000倍后,效价仍>10000。竞争法检测结果显示,5#大白兔血浆样本低值与高值的比值为2:1,优于其他大白兔。选取5#大白兔进行噬菌体文库构建。使用常规聚合酶链反应扩增出VL及VH基因片段,经搭桥拼接成ScFv(VL+VH)后,琼脂凝胶电泳分析可看到750 bp左右大小条带,与最初设计的片段大小一致。ScFv经酶切连接电转至大肠杆菌TG1中,构建一个库容为4.73×10^(8) cfu·mL^(-1)的噬菌体文库。经3轮淘洗出库平皿挑取300个单克隆,制备单克隆噬菌体,ELISA结果显示,300个克隆中阳性率达100%,校准品竞争检测阳性克隆42个,筛出率14%;42个阳性克隆进一步进行临床样本竞争检测,筛出16株单克隆符合要求,将16株进行复测,2次检测结果一致;测序后优选6条抗体序列进行构建表达,纯化后SDS-PAGE还原胶电泳结果显示,在重链50000及轻链25000位置均有条带,获得6株高亲和力、竞争性的兔ALD单抗。结论通过噬菌体展示技术成功筛选出6株高亲和力、竞争性的兔ALD抗体,这为小分子抗体的发现提供了一种参考方法。筛选出的AD185、AD277抗体在校准品及临床样本竞争中,均表现出比阳性对照高出2倍的竞争优势,这为ALD检测试剂盒原材料的开发提供了可能性。 展开更多

关键词 噬菌体展示 醛固酮抗体 蛋白A亲和纯化

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哺乳动物细胞CHO制备重组抗体关键技术研究进展

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作者 孙静静 王格 +1 位作者 赵巧辉 李桂林 《中国医药生物技术》 2021年第4期348-353,共6页

哺乳动物细胞能够提供复杂的翻译后修饰,表达蛋白性质与天然蛋白接近,使蛋白药物更加稳定有效。自1987年FDA批准第一个中国新药组织型纤溶酶原激活剂(TPA),哺乳动物细胞广泛应用于重组蛋白的生产,开始了工业化生产之路。在生物制药行业... 哺乳动物细胞能够提供复杂的翻译后修饰,表达蛋白性质与天然蛋白接近,使蛋白药物更加稳定有效。自1987年FDA批准第一个中国新药组织型纤溶酶原激活剂(TPA),哺乳动物细胞广泛应用于重组蛋白的生产,开始了工业化生产之路。在生物制药行业几十年的快速发展中,哺乳动物CHO细胞成功生产了众多细胞因子、重组酶、重组抗体、重组融合蛋白等有价值的生物技术药物,为市场需求作出重大贡献,同时也奠定了它在生产细胞中的优势地位。抗体药物是现代生物医药产业的主力军,占全球生物药物市场的50%以上,是生物医药产业增长最快的细分领域,抗体药越来越多地应用于几乎所有的医学分支,抗体疗法的日益成功推动了重组抗体技术和生产设施的设计和管理。抗体药物自身有着不容忽视的问题,如结构复杂不稳定、大规模生产复制困难、研发周期长、生产成本高、工艺复杂等[1]。随着国内抗体药物的发展和应用,降低成本成为企业的主要任务,提高蛋白表达量是降低成本的主要手段之一。 展开更多

关键词 生物医药产业 细分领域 抗体药物 生物技术药物 生物制药行业 重组抗体 组织型纤溶酶原激活剂 生物药物

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民办高校生物医药专业创新创业教育模式探究

3

作者 胡焕焕 姬国杰 +3 位作者 刘瑞 赵枭阳 朱婷 卢龙斗 《科教导刊（电子版）》 2020年第12期55-55,共1页

创新创业教育是培养企业所需优秀人才的重要途径,本文以新乡医学院三全学院为例,对民办高校生物医药专业创新创业教育模式进行探讨。

关键词 民办高校 创新创业 课程体系 人才培养

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RNA病毒核酸检测质控品大规模生产的研究

4

作者 王晓姣 李婷 +1 位作者 赵巧辉 李桂林 《检验医学与临床》 2023年第S02期57-60,共4页

目的大批量、低成本的质控品是核酸检测质量保证中必不可少的原料,针对RNA病毒质控品的大规模制备鲜有研究。方法利用装甲RNA技术,首次通过大肠杆菌发酵技术进行冠状病毒噬菌体病毒样颗粒(假病毒)包装表达。结果通过对大肠杆菌发酵条件... 目的大批量、低成本的质控品是核酸检测质量保证中必不可少的原料,针对RNA病毒质控品的大规模制备鲜有研究。方法利用装甲RNA技术,首次通过大肠杆菌发酵技术进行冠状病毒噬菌体病毒样颗粒(假病毒)包装表达。结果通过对大肠杆菌发酵条件进行优化,可稳定制备出单批产能>0.3 L的冠状病毒假病毒。该冠状病毒假病毒包装完整,且线性及稳定性良好,满足样品大规模投料使用需求。具有耐核酸酶、高稳定性、易保存和运输等优点,可被广泛应用于冠状病毒核酸检测试剂盒。结论RNA病毒检测质控品可通过发酵技术实现大规模生产及应用。 展开更多

关键词 RNA病毒 质控品 发酵 假病毒

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基于大肠杆菌表达系统的重组蛋白疫苗研究进展

5

作者 周清华 徐延伟 +3 位作者 赵巧辉 张春鸽 王贝贝 李桂林 《现代诊断与治疗》 CAS 2023年第18期2730-2735,共6页

疫苗在流行病预防中发挥了重要作用,重组蛋白疫苗具有廉价足量、安全性良好的优势。作为一种成本效益高、生长迅速、基因操作便捷的宿主,大肠杆菌中已成功实现了重组B群脑膜炎球菌疫苗、重组人乳头瘤病毒疫苗、重组戊型肝炎疫苗等重组... 疫苗在流行病预防中发挥了重要作用,重组蛋白疫苗具有廉价足量、安全性良好的优势。作为一种成本效益高、生长迅速、基因操作便捷的宿主,大肠杆菌中已成功实现了重组B群脑膜炎球菌疫苗、重组人乳头瘤病毒疫苗、重组戊型肝炎疫苗等重组蛋白疫苗的生产制备和商业化应用。本文综述了基于大肠杆菌表达系统进行重组蛋白疫苗开发的研究现状,介绍了该宿主中已上市和进入临床阶段的预防性疫苗和治疗性疫苗的研发情况,为大肠杆菌表达系统中重组蛋白疫苗的开发和进一步优化提供理论指导。 展开更多

关键词 疫苗 重组蛋白疫苗 大肠杆菌 研究进展

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人性激素结合球蛋白的真核表达、纯化鉴定及质控品应用分析

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作者 王晓姣 徐延伟 +3 位作者 赵巧辉 李婷 吕委 李桂林 《检验医学与临床》 CAS 2021年第21期3137-3140,共4页

目的构建人性激素结合球蛋白(SHBG)的重组真核表达载体,获得高纯度的人SHBG重组蛋白。方法根据人SHBG基因序列,利用Primer Premier 6.0设计引物,扩增获得人SHBG基因;构建人SHBG-pCMV3H重组真核表达载体;将其转染至HEK-293F细胞,提取人S... 目的构建人性激素结合球蛋白(SHBG)的重组真核表达载体,获得高纯度的人SHBG重组蛋白。方法根据人SHBG基因序列,利用Primer Premier 6.0设计引物,扩增获得人SHBG基因;构建人SHBG-pCMV3H重组真核表达载体;将其转染至HEK-293F细胞,提取人SHBG重组蛋白,并用ConA柱亲和层析法纯化;采用人SHBG检测试剂盒对其蛋白浓度进行鉴定。结果人SHBG基因产物长度与预期一致,约为1200 bp;测序比对分析结果显示人SHBG基因成功插入pCMV3H载体;电泳结果显示在相对分子质量约为42×10^(3)处有一明显条带,与预期蛋白质位置一致;人SHBG检测试剂盒鉴定结果显示人SHBG重组蛋白作为质控品与西门子、安图生物、罗氏一致性良好;含钙离子缓冲液中人SHBG重组蛋白稳定性优于不含钙离子缓冲液。结论真核表达人SHBG重组蛋白能够作为SHBG检测试剂的质控品,且各厂家检测一致性良好;钙离子有利于提升人SHBG蛋白的稳定性。 展开更多

关键词 人性激素结合球蛋白 真核表达 蛋白质纯化

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HSV-IgM人-鼠嵌合抗体制备及稳定细胞株构建工艺开发 被引量：1

7

作者 崔亚敏 田晓平 +3 位作者 孙静静 王志强 赵巧辉 李桂林 《生物工程学报》 CAS CSCD 北大核心 2023年第9期3887-3898,共12页

为实现体外大规模制备单纯疱疹病毒HSV-IgM(HSV1,HSV2)人鼠嵌合抗体,本研究通过RNA连接酶介导的cDNA末端快速扩增(RNA ligase-mediated rapid amplification of cDNA ends,RLM-RACE)技术获取其对应杂交瘤细胞基因序列,构建嵌合抗体至真... 为实现体外大规模制备单纯疱疹病毒HSV-IgM(HSV1,HSV2)人鼠嵌合抗体,本研究通过RNA连接酶介导的cDNA末端快速扩增(RNA ligase-mediated rapid amplification of cDNA ends,RLM-RACE)技术获取其对应杂交瘤细胞基因序列,构建嵌合抗体至真核表达载体,在CHO-S细胞中稳定表达所需目的蛋白。同时优化稳定细胞株筛选工艺,对细胞池构建阶段和单克隆筛选阶段的加压条件进行摸索与探究,最后目的抗体采用蛋白L亲和纯化法进行纯化并进行生物活性检测;最终成功制备899 kDa和909 kDa的稳定高表达重组IgM抗体(HSV1,HSV2)细胞株。结果表明,最适筛选压力为20P200M(一轮加压)和50P1000M(二轮加压);使用加压培养基进行单克隆筛选抗体表达量较高,HSV1-IgM和HSV2-IgM单克隆最终表达量分别为1620 mg/L和623 mg/L。本研究为HSV1和HSV2的IgM系列重组抗体质控品开发以及体外高表达分泌IgM亚型抗体提供理论与实践基础。 展开更多

关键词 人鼠嵌合IgM抗体 CHO-S细胞 构建工艺 表达

原文传递

阻断剂单克隆抗体制备及表达工艺优化

8

作者 崔亚敏 李昕益 +5 位作者 田晓平 孙静静 宋子博 周雷鸣 赵巧辉 李桂林 《生物技术》 CAS 2023年第5期551-557,共7页

[目的]体外制备阻断剂单克隆抗体,并对表达工艺进行优化。[方法]通过RLM-RACE技术钓取杂交瘤细胞抗体基因序列,经分子克隆构建至真核表达载体pCHO1.0,在CHO-S细胞中构建稳定表达细胞株;运用DOE实验设计方法,筛选最佳培养基、培养温度及... [目的]体外制备阻断剂单克隆抗体,并对表达工艺进行优化。[方法]通过RLM-RACE技术钓取杂交瘤细胞抗体基因序列,经分子克隆构建至真核表达载体pCHO1.0,在CHO-S细胞中构建稳定表达细胞株;运用DOE实验设计方法,筛选最佳培养基、培养温度及补料方式;在5 L生物反应器进行工艺验证,蛋白A亲和纯化后用化学发光法进行阻断性能验证。[结果]目的基因序列钓取成功,稳定表达单克隆细胞株11H7表达量为2.90 g/L;使用CHO Max A培养基、梯度补料策略、32℃培养可将表达量提升至5.28 g/L,5 L生物反应器表达量为5.47 g/L,纯度均>95%,且在磁微粒G17和ProGRP项目异常样本中检测满足阻断性能需求。[结论]阻断剂单克隆抗体构建成功,通过表达工艺优化,表达量由2.90 g/L提升至5.28 g/L,且在生物反应器中得到初步验证。 展开更多

关键词 阻断剂单克隆抗体 CHO-S细胞 稳定细胞株 DOE实验设计 生物反应器

原文传递

不同信号肽对人鼠嵌合CMV-IgM分泌表达的影响 被引量：3

9

作者 崔亚敏 田晓平 +1 位作者 赵巧辉 李桂林 《生物工程学报》 CAS CSCD 北大核心 2020年第6期1223-1231,共9页

为了实现在体外制备巨细胞病毒-免疫球蛋白M(CMV-IgM)和探讨不同信号肽对CMV-IgM表达的影响,通过RLM-RACE技术钓取杂交瘤细胞基因序列,构建人鼠嵌合CMV-IgM表达载体,并通过PCR方法将5种不同的分泌型信号肽(SigA–SigE)代替CMV-IgM自身... 为了实现在体外制备巨细胞病毒-免疫球蛋白M(CMV-IgM)和探讨不同信号肽对CMV-IgM表达的影响,通过RLM-RACE技术钓取杂交瘤细胞基因序列,构建人鼠嵌合CMV-IgM表达载体,并通过PCR方法将5种不同的分泌型信号肽(SigA–SigE)代替CMV-IgM自身信号肽(SigF),利用中国仓鼠卵巢细胞(CHO)作为宿主细胞进行体外表达。对纯化后的CMV-IgM进行SDS-PAGE、SEC-HPLC和酶联免疫吸附试验(ELISA)确定其蛋白表达水平与免疫反应性,最终成功制备出910 kDa的重组蛋白,且研究表明,5种信号肽(SigA–SigE)的人鼠嵌合CMV-IgM表达量较CMV 6#细胞株自身信号肽SigF相比,分别提高了6.72、5.19、1.44、1.85、1.98倍。这将对人鼠嵌合CMV-IgM的开发提供理论基础,且为提高CMV-IgM表达量的研究工作提供了新思路。 展开更多

关键词 巨细胞病毒-免疫球蛋白M 人鼠嵌合 信号肽 表达

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CA50靶向抗体文库的构建筛选及应用评价

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作者 杜鲁涛 赵巧辉 +9 位作者 田晓平 吴学炜 付光宇 渠海 苗拥军 王丽丽 郑桂喜 郭海洋 李桂林 王传新 《山东大学学报（医学版）》 CAS 北大核心 2018年第10期51-57,共7页

目的获得针对CA50靶点的高亲和力、高特异性抗体,建立体外诊断CA50检测试剂盒,提高肿瘤诊断的特异性和灵敏度。方法 PCR技术获得单链抗体(ScFv)基因并克隆入pcomb3XSS噬粒载体,通过电转化获得ScFv噬菌体抗体库。用CA50特性识别表位LST a... 目的获得针对CA50靶点的高亲和力、高特异性抗体,建立体外诊断CA50检测试剂盒,提高肿瘤诊断的特异性和灵敏度。方法 PCR技术获得单链抗体(ScFv)基因并克隆入pcomb3XSS噬粒载体,通过电转化获得ScFv噬菌体抗体库。用CA50特性识别表位LST a(唾液酸化-乳糖-N-四糖a)的抗原淘洗筛选,获得针对CA50靶点的特异性抗体基因序列。随机挑选克隆测序,验证ScFv抗体库的多样性。利用重叠PCR技术获得人鼠嵌合抗体基因,经过抗体表达纯化及配对筛选建立双抗体夹心法CA50检测试剂盒。同时收集临床诊断阳性样本54例和临床阴性对照样本146例,利用该研究建立的CA50检测试剂盒与罗氏CA50试剂盒进行平行对照,评价其检测相关性。结果建立噬菌体抗体库的容量为2. 5×108,具有较好的多样性。24个PCR鉴定阳性克隆测序,结果为20个正确插入且插入序列均不相同。经过3轮淘洗筛选出5个阳性克隆,经过抗体配对筛选建立的CA50试剂盒临床样本检测结果与罗氏的临床相关性(r=0. 98)。结论通过噬菌体展示抗体库技术成功筛选出了针对CA50的高特异性、高亲和力抗体,为CA50检测在相关肿瘤辅助诊断中的应用提供可能性。 展开更多

关键词 CA50靶点 诊断 抗体库 评价

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重组表达HIV不同亚型gp41蛋白的抗原表位暴露情况分析 被引量：1

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作者 赵巧辉 李桂林 +3 位作者 徐延伟 付光宇 吴学炜 杨增利 《中国卫生检验杂志》 CAS 2020年第1期15-17,30,共4页

目的通过化学发光法检测原核重组HIV I型4种不同亚型gp41膜外区蛋白对阴阳性标本的反应性,间接反映重组表达gp41膜外区蛋白的抗原表位暴露情况,为科研、临床异常标本分析提供分析方法。方法选取HIV I型4个国内主流基因型(BC、AE、B、C)... 目的通过化学发光法检测原核重组HIV I型4种不同亚型gp41膜外区蛋白对阴阳性标本的反应性,间接反映重组表达gp41膜外区蛋白的抗原表位暴露情况,为科研、临床异常标本分析提供分析方法。方法选取HIV I型4个国内主流基因型(BC、AE、B、C)膜外区序列,克隆至pGEX4T-3载体中,优化目标蛋白的纯化工艺,制备出HIV I型gp41膜外区相应蛋白作为包被抗原,与商品化gp41-HRP酶结合物配对后,夹心法进行HIV I型阴阳性标本反应性的测试,从而判断相应蛋白抗原表位暴露情况。结果HIV I型4个亚型的gp41膜外区相同区段在pGEX4T-3原核载体中均能表达出符合预期大小的目的蛋白;纯化后分别作为包被抗原,按相同浓度包被后进行HIV I型阴阳性标本的测试,结果显示不同亚型的gp41表达蛋白与商品化gp41-HRP酶反应性存在较大差异。结论通过原核表达系统高效表达了HIV I型主流亚型gp41膜外区蛋白,化学发光法组建夹心法进行阴阳性标本测试,其反应性不一致,间接反映出不同基因型选取同一表达区域进行体外重组表达其结构折叠方式有区别,此研究为HIV科研、临床标本验证等提供了基础。 展开更多

关键词 HIV I型 GP41 重组表达 膜外区蛋白 化学发光

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