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IRES核心区12-bp非连续插入突变对猪塞内卡病毒复制和细胞嗜性的影响
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作者 张晓战 董轩志 +10 位作者 吕楠楠 刘懿雯 马新甜 王林青 夏艳勋 蒋增海 郭运泽 赵攀登 宋予震 杨德成 边传周 《中国农业科学》 CAS CSCD 北大核心 2024年第7期1407-1416,共10页
【背景】塞内卡病毒(senecavirus A,SVA)是新近暴发的一种引起猪特发性水疱病及仔猪死亡的小核糖核酸病毒。该病毒基因组5′非编码区(untranslated region,UTR)中的内部核糖体进入位点(IRES)元件在病毒复制过程中发挥重要作用。2017年... 【背景】塞内卡病毒(senecavirus A,SVA)是新近暴发的一种引起猪特发性水疱病及仔猪死亡的小核糖核酸病毒。该病毒基因组5′非编码区(untranslated region,UTR)中的内部核糖体进入位点(IRES)元件在病毒复制过程中发挥重要作用。2017年我国出现IRES核心区Domain II 12个碱基非连续插入的自然突变SVA毒株,在病毒复制和致病性方面存在明显改变。【目的】探讨IRES Domain II区域发生的突变对SVA的复制及细胞嗜性的影响,为进一步了解SVA致病机制奠定基础。【方法】以实验室前期构建的含HeN-1/2018株全基因组感染性克隆pHeN-1/2018为基础,通过定点突变的方式,逐步将其IRES Domain II核心区域308—317 nt的9个碱基(ACTCAAGCG)替换为GD04/2017株基因组308—328 nt的21个碱基(CACGCCTGCCGATAGACGATT),构建重组载体pHeN-1/2018-i12并进行了病毒拯救。随后,利用病毒基因组克隆测序、间接免疫荧光试验和Western blot试验对所拯救病毒进行鉴定,同时验证了IRES核心区12个碱基插入突变对SVA病毒体外复制能力和细胞嗜性的影响。【结果】将构建完成的重组载体pHeN-1/2018-i12转染细胞,盲传至P2代,获得致使感染细胞病变明显、病变时间稳定的IRES突变病毒rHeN-1/2018-i12。病毒连续传代后测序结果表明rHeN-1/2018-i12遗传稳定,P5代病毒基因组序列未发生碱基突变,P10代病毒IRES区域没有出现突变现象。用低代次的突变病毒rHeN-1/2018-i12体外感染本体动物猪源细胞系PK-15和IBRS-2,及仓鼠源细胞系BHK-21,进行细胞感染试验,结果表明rHeN-1/2018-i12与亲本毒株rHeN-1/2018在PK-15、IBRS-2和BHK-21中均能导致明显的细胞病变,表现出相似的生长曲线趋势,表明IRES核心区Domain II 12个碱基突变不能够改变对上述细胞的嗜性;但SVA突变病毒和亲本株在不同细胞中的病变时间及病毒滴度上存在较大的差异,rHeN-1/2018-i12株在细胞中生长能力较其亲本株rHeN-1/2018差,诱使细胞病变的时间较晚,在感染24 hpi,两者病毒滴度相差可达10倍。【结论】本研究基于SVA反向遗传操作系统构建并拯救SVA IRES突变毒株,确定了IRES突变对SVA生物学特性的影响,有助于我们更好地了解SVA致病机制,拓宽我们对病毒IV型IRES功能的认识。 展开更多
关键词 塞内卡病毒 内部核糖体进入位点 反向遗传操作系统 病毒复制 细胞嗜性
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程序性死亡分子1胞外区的表达及其抗血清对PCV2增殖的影响
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作者 王林青 徐朋丽 +3 位作者 陈曦艋 李洪炫 陈红英 赵丽 《安徽农业大学学报》 CAS CSCD 2022年第3期443-448,共6页
为研究猪的程序性死亡分子1(PD-1)胞外区参与猪圆环病毒2型(porcine circovirus type 2,PCV2)感染的免疫调节功能,PCR扩增健康猪舌组织中PD-1胞外区,构建重组表达质粒p ET-28a-PD-1,转化至Rosetta(DE3)。经IPTG诱导表达后,采用SDS-PAGE... 为研究猪的程序性死亡分子1(PD-1)胞外区参与猪圆环病毒2型(porcine circovirus type 2,PCV2)感染的免疫调节功能,PCR扩增健康猪舌组织中PD-1胞外区,构建重组表达质粒p ET-28a-PD-1,转化至Rosetta(DE3)。经IPTG诱导表达后,采用SDS-PAGE和Western Blot检测重组PD-1胞外段蛋白ex PD-1表达情况。结果显示,重组菌p ET-28a-PD1/DE3,在37℃、0.5 mmol·L-1 IPTG诱导8 h时,ex PD-1蛋白的表达量最高,大小约为20 kDa,且以包涵体形式表达。然后将经纯化和复性获得的ex PD-1辅以佐剂免疫新西兰兔,制备兔抗ex PD-1血清,经Western Blot检测结果显示该抗血清具有较好的反应原性。用PCV2感染猪肾(Porcinekidney-15,PK-15)细胞,采用荧光定量PCR检测PD-1转录水平,结果显示PCV2感染PK-15细胞1~48 h时PD-1的m RNA转录水平均下调;用兔抗ex PD-1血清处理PK-15细胞后感染PCV2,PD-1的转录水平显著上调(P<0.01),且明显地抑制了PCV2的复制(P<0.01)。上述结果表明,在体外PCV2感染可引起PD-1转录水平下调,兔抗ex PD-1血清可通过封闭PD-1/PD-L1通路,抑制PCV2增殖。 展开更多
关键词 程序性死亡分子1 表达 兔抗PD-1血清 PCV2
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河南省猪伪狂犬病病毒野毒感染血清学调查及gE基因遗传变异分析 被引量:2
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作者 王林青 赵丽 +5 位作者 陈曦艋 吴少峰 韩莹莹 刘芳 金钺 陈红英 《中国畜牧兽医》 CAS CSCD 北大核心 2023年第8期3364-3372,共9页
【目的】调查河南省猪伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)野毒流行特征及遗传变异情况。【方法】用ELISA法检测2020-2021年从河南省766个不同养殖规模猪场采集的25411份血清样本的gE抗体水平;采用PCR法对从47个猪场疑似PRV感染猪群... 【目的】调查河南省猪伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)野毒流行特征及遗传变异情况。【方法】用ELISA法检测2020-2021年从河南省766个不同养殖规模猪场采集的25411份血清样本的gE抗体水平;采用PCR法对从47个猪场疑似PRV感染猪群中收集的251份病料进行gE基因扩增,并将阳性病料样品接种ST细胞进行病毒分离、gE全基因测序和遗传进化分析。【结果】血清样品gE抗体总阳性率为18.42%,从2020年的20.32%降至2021年的16.69%,猪场阳性率为50.26%。随着猪场规模增大,猪场阳性率、血清样本阳性率呈下降趋势;商品代养殖场、屠宰场和种猪场的场阳性率、血清样本阳性率依次降低;豫东、豫西、豫南、豫北和豫中血清gE抗体阳性率分别为15.05%、23.48%、16.50%、16.69%和20.10%,1-3月阳性率最高,10-12月最低。组织病料样品中PRV阳性率为15.14%(38/251),从PRV阳性病料样品中共分离出9株PRV分离株。gE全基因序列遗传进化分析结果显示,分离株都属于GenotypeⅡ型,且猪群中既有PRV经典株也有PRV变异株。【结论】河南省猪场中仍然存在PRV感染,且同时存在PRV经典株和PRV变异株,本研究结果为河南省猪伪狂犬病的防控与净化提供参考依据。 展开更多
关键词 伪狂犬病病毒(PRV) 血清学调查 GE基因 遗传变异
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猪圆环病毒2型/3型双重荧光定量PCR检测方法 被引量:5
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作者 王林青 樊霖 +5 位作者 赵宇 田润博 崔建涛 韩昊莹 赵丽 陈红英 《安徽农业大学学报》 CAS CSCD 2021年第4期595-599,共5页
为了能够同时快速地检测和鉴别猪圆环病毒2型和3型(PCV2和PCV3),参考GenBank中已发表的PCV2和PCV3基因组序列,针对其保守区分别设计了2对特异性引物,经优化反应体系和条件,建立了能快速检测和鉴别PCV2/PCV3双重荧光定量PCR方法。结果表... 为了能够同时快速地检测和鉴别猪圆环病毒2型和3型(PCV2和PCV3),参考GenBank中已发表的PCV2和PCV3基因组序列,针对其保守区分别设计了2对特异性引物,经优化反应体系和条件,建立了能快速检测和鉴别PCV2/PCV3双重荧光定量PCR方法。结果表明,PCV2和PCV3的R2分别为0.999、0.9993,E值分别为3.5731、3.3734。该方法能同时特异地检测PCV2和PCV3,而对其他5种猪病原均未检测到荧光信号;PCV2和PCV3的最低检测值分别为41.1 copies·μL^(-1)、27.0 copies·μL^(-1);批内和批间变异系数均小于1%。临床样本检测结果显示,PCV2和PCV3的阳性率分别为62.12%(41/66)、48.48%(32/66),二者混合感染的阳性率为46.96%(31/66)。表明该方法具有敏感、特异和可靠等特点,该方法为PCV2和PCV3单独或者混合感染的早期诊断、定量检测及其流行病学调查提供了可行的技术支持。 展开更多
关键词 猪圆环病毒 PCV2和PCV3 双重荧光定量PCR 检测
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猪伪狂犬病病毒和猪圆环病毒3型双重SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR方法的建立
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作者 金钺 陈曦艋 +4 位作者 李洪炫 赵宇 李新生 陈红英 王林青 《安徽农业大学学报》 CAS CSCD 2022年第4期590-594,共5页
为了同时检测猪伪狂犬病病毒(PRV)野毒和猪圆环病毒3型(PCV3),基于PRV g E基因和PCV3 Rep基因保守序列各合成了1对引物,在优化反应体系和扩增条件的基础上,建立了检测PRV和PCV3的双重SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法。结果显示:PRV和PCV3... 为了同时检测猪伪狂犬病病毒(PRV)野毒和猪圆环病毒3型(PCV3),基于PRV g E基因和PCV3 Rep基因保守序列各合成了1对引物,在优化反应体系和扩增条件的基础上,建立了检测PRV和PCV3的双重SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法。结果显示:PRV和PCV3的Tm值分别为87和81.5℃,能特异地检测PRV和PCV3,而对其他5种猪病原均未检测到荧光信号;PRV和PCV3的最低检测值分别为37.0和33.8copies·μL^(-1);批内批间变异系数均小于2%;对2017—2019年期间采自河南地区的78份猪临床样品进行检测,PRV和PCV3的阳性率分别为19.23%(15/78)和41.03%(32/78),二者混合感染的阳性率为8.97%(7/78)。表明该方法具有高度的敏感性、特异性和稳定性,可用于监测PRV野毒和PCV3及其流行病学调查。 展开更多
关键词 猪伪狂犬病病毒 猪圆环病毒3型 荧光定量PCR
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表达高致病性和NADC30样PRRSV毒株GP5蛋白的重组伪狂犬病病毒的构建
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作者 王林青 侯承尧 +4 位作者 马晓 刘颖 刘芳 金钺 陈红英 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2023年第8期1587-1593,共7页
参考猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)株HENAN-XINX基因组序列(GenBank登录号:KF611905)中GP5基因,合成1对特异性引物,BamHⅠ和HindⅢ分别引入到其5′端,RT-PCR扩增NADC30样PRRSV(NADC30-like PRRSV)毒株GP5基因。将扩增片段插入到真核表... 参考猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)株HENAN-XINX基因组序列(GenBank登录号:KF611905)中GP5基因,合成1对特异性引物,BamHⅠ和HindⅢ分别引入到其5′端,RT-PCR扩增NADC30样PRRSV(NADC30-like PRRSV)毒株GP5基因。将扩增片段插入到真核表达质粒pBApo-EF1α_Pur_DNA的BamHⅠ和HindⅢ位点,然后扩增含GP5/NA的表达盒,将其导入含高致病性PRRSV(HP-PRRSV)GP5基因的伪狂犬病病毒(PRV)转移质粒pG-GP5/HP-EGFP中,构建重组质粒pG-GP5/HP-GP5/NADC30-EGFP。用脂质体转染法将PRV变异株3基因缺失株rPRV-gE-/gI-/TK-基因组与pG-GP5/HP-GP5/NADC30-EGFP质粒共转染ST细胞,得到携带有HP-PRRSV和NADC30-like PRRSV的GP5基因和绿色荧光蛋白标记基因的重组PRV株rPRV-GP5/HP-GP5/NADC30-EGFP。该重组病毒与CRISPR/Cas9-EGFP敲除质粒共转染ST细胞,经4轮病毒空斑纯化得到了无绿色荧光标签的重组病毒rPRV-GP5/HP-GP5/NADC30株。经PCR和RT-PCR证实成功构建重组病毒rPRV-GP5/HP-GP5/NADC30。 展开更多
关键词 NADC30-like PRRSV HP-PRRSV GP5基因 重组PRV
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