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慢病毒介导人PERK基因修饰对内质网应激介导凋亡的影响
1
作者 张鹏 夏飞 +2 位作者 李美玲 韩晓凤 郭风劲 《第二军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2014年第11期1183-1190,共8页
目的构建人蛋白激酶R样内质网激酶(protein kinase R-like ER kinase,PERK)慢病毒载体并包装慢病毒颗粒(lentivirus),探讨成肌细胞C2C12中PERK基因慢病毒修饰对内质网应激介导凋亡的作用。方法设计并合成人PERK基因的上、下游引物,采用... 目的构建人蛋白激酶R样内质网激酶(protein kinase R-like ER kinase,PERK)慢病毒载体并包装慢病毒颗粒(lentivirus),探讨成肌细胞C2C12中PERK基因慢病毒修饰对内质网应激介导凋亡的作用。方法设计并合成人PERK基因的上、下游引物,采用PCR方法从真核质粒pcDNA3.l(-)-PERK中扩增目的基因。鉴定后与慢病毒载体pWPT-GFP进行重组,再将重组慢病毒载体pWPT-GFP-PERK与慢病毒包装质粒pMD2G、pSPAX2共转入293T细胞中,进一步包装形成PERK慢病毒(LV-PERK);收集转染后48h的细胞上清,体外感染成肌细胞C2C12,观察绿色荧光蛋白(GFP)感染效率,并应用流式细胞仪(FCM)检测内质网应激时重组慢病毒PERK对C2C12细胞增殖凋亡的影响,蛋白质印迹法检测凋亡相关基因Cleaved Caspase-3与Chop蛋白的表达。结果成功构建和包装了滴度为4.2×108 efu/mL的PERK重组慢病毒。FCM检测结果表明,TM+LV-PERK处理组G1期细胞比例为54.37%,低于TM组(77.91%)和LV-GFP组(66.41%);TM+LVPERK处理组S期细胞比例为31.36%,高于TM组(12.14%)和LV-GFP组(16.96%),各组差异均具有统计学意义(P<0.05);此外,TM+LV-PERK处理组细胞凋亡率为25.91%,高于TM组(11.79%)和Ad-GFP组(11.24%),各组差异具有统计学意义(P<0.05)。免疫印迹检测Cleaved Caspase-3和Chop蛋白的表达与FCM结果一致。结论成功构建和包装LVPERK重组慢病毒颗粒,在内质网应激时,LV-PERK慢病毒可促进C2C12细胞的增殖和凋亡。 展开更多
关键词 PERK 慢病毒 成肌细胞 内质网应激 细胞凋亡
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IRE1α上调人骨肿瘤细胞XBP1启动子转录活性的研究 被引量：3
2
作者 李祥柱 赵文君 +2 位作者 刘艳娜 周菁华 郭风劲 《医学分子生物学杂志》 CAS CSCD 2012年第3期171-177,共7页
目的研究内质网跨膜蛋白肌醇酶1α（inositol-requiring enzyme 1α，IRE1α）对其下游转录因子XBP1启动子转录活性的影响。方法在成功构建人IREla基因全长重组质粒的基础上，设计合成并构建靶向IRE1α基因的siRNA干扰载体（pS1；pS2）... 目的研究内质网跨膜蛋白肌醇酶1α（inositol-requiring enzyme 1α，IRE1α）对其下游转录因子XBP1启动子转录活性的影响。方法在成功构建人IREla基因全长重组质粒的基础上，设计合成并构建靶向IRE1α基因的siRNA干扰载体（pS1；pS2）；采用巢式PCR扩增XBP1启动子，插入到pGL3．Basic载体，构建携带XBP1启动子的报告基因重组质粒pGL3-XBP1。分别将siIRE1α干扰质粒与pGL3-XBPl报告基因重组质粒共转染人SW1353细胞和Saos-2细胞中，48h后采用双荧光报告系统检测IRE1α对XBP1启动子转录活性的调控作用。结果酶切及测序结果证实siRNA1干扰质粒和XBPl启动子真核表达载体均构建成功，双荧光报告系统检测显示SW1353细胞和Saos-2细胞中，直接载体pcDNA3．15（-）IRE1α与pGL3-XBP1共转实验组的荧光素酶活性明显高于其他实验组（P〈0．5），并随着IRE1α转染剂量的增加逐渐达到饱和；而silRE1α与pGL3-XBP1共转实验组的荧光素酶活性明显降低。免疫印迹结果显示，过表达IRE1α明显上调剪接型XBPlS蛋白的表达。结论人恶性骨肿瘤细胞中，过表达IRE1α明显上调XBP1启动子的转录与表达，并能有效促进XBPIU剪切生成XBPIU；通过siRNA方法抑制IRE1α后，XBP1启动子的转录与表达受到抑制。本实验为进一步研究骨肿瘤细胞中IRE1α调控XBP1启动子转录与剪接的分子机制奠定基础，为临床骨肿瘤的诊断与治疗提供一定的实验依据。 展开更多
关键词 IRE1α XBP1启动子 转录活性 骨肿瘤
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携人ATF6重组腺病毒载体的构建及对C28I2细胞增殖及凋亡的影响 被引量：3
3
作者 韩晓凤 张鹏 +2 位作者 李美玲 夏飞 郭风劲 《医学分子生物学杂志》 CAS 2013年第4期187-192,共6页
目的构建携带人活化转录因子6（ activating transcription factor 6, ATF6）的重组腺病毒，观察其对软骨细胞C2812增殖及凋亡的影响。方法将ATF6基因克隆人pAdTrack-cmv质粒，经pme I线性化后的重组穿梭质粒pAdTrack-ATF6通过电转法与... 目的构建携带人活化转录因子6（ activating transcription factor 6, ATF6）的重组腺病毒，观察其对软骨细胞C2812增殖及凋亡的影响。方法将ATF6基因克隆人pAdTrack-cmv质粒，经pme I线性化后的重组穿梭质粒pAdTrack-ATF6通过电转法与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1在BJ5183感受态中同源重组．挑选阳性克隆，获得重组腺病毒质粒pad-ATF6。通过脂质体介导转染HEK-293细胞。得到重组腺病毒Ad-ATF6，并采用PCR法对重组腺病毒进行鉴定。Ad-ATF6感染软骨细胞C2812．通过Western印迹检测ATF6的表达，并应用流式细胞仪检测Ad-ATF6对C2812细胞增殖和凋亡的影响。结果成功构建了携带人ATF6基因的重组腺病毒质粒，并成功包装了具有高效感染力的Ad-ATF6腺病毒。Western印迹结果表明．Ad-ATF6感染组ATF6的表达明显增加。FCM检测结果表明，Ad-ATF6处理组G，期的细胞比例分别比Nc组和Ad-GFP组高28．42％和30．50％（P〈0．5）．S期的细胞比例分别比Nc组和Ad-GFP组低22．43％和24．10％（P〈0．5）；凋亡率比Nc组和Ad-GFP组高出21．98％和19．65％（P〈0．5）。结论可高表达ATF6的腺病毒包装成功，感染C2812细胞后。抑制了C2812细胞的增殖并促进其凋亡．为后续研究AqT6基因的生物学功能奠定了基础，为与内质网应激相关的软骨发育疾病提供了一定的参考价值。 展开更多
关键词 人活化转录因子6 重组腺病毒 C28I2细胞 细胞增殖凋亡
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Ad—XBP15重组腺病毒对ATDC5细胞周期与凋亡的效应研究 被引量：2
4
作者 刘艳娜 周菁华 +2 位作者 张鹏 韩晓凤 郭风劲 《医学分子生物学杂志》 CAS CSCD 2012年第5期326-332,共7页
目的构建重组人剪接型X盒结合蛋白1（X—boxbindingprotein1spliced，XBP1S）并探讨其对软骨祖细胞ATDC5周期和凋亡的影响。方法应用pAdEasy“腺病毒载体系统，构建得到XBP1S基因全长的重组穿梭质粒pAdTrack—XBP1S，通过电转法同腺病... 目的构建重组人剪接型X盒结合蛋白1（X—boxbindingprotein1spliced，XBP1S）并探讨其对软骨祖细胞ATDC5周期和凋亡的影响。方法应用pAdEasy“腺病毒载体系统，构建得到XBP1S基因全长的重组穿梭质粒pAdTrack—XBP1S，通过电转法同腺病毒骨架质粒pAdEasy—1进行同源重组，获得重组腺病毒pad．XBP1S。随后在HEK-93细胞中包装并扩增重组腺病毒颗粒Ad—XBP1S。用直接PCR法鉴定重组腺病毒。体外感染软骨祖细胞ATDC5，观察绿色荧光蛋白（GFP）感染效率，并应用流式细胞仪（FCM）分别在加入毒胡萝卜素（tunicamycin，TM）和不加入TM的条件下，检测重组腺病毒Ad—XBP1S对ATDC5细胞周期和凋亡的影响。结果酶切鉴定和PCR证实成功构建了重组腺病毒质粒pAd．XBP1S。FCM检测结果表明，在ERS条件下，Ad—XBP1S实验组ATDC5细胞G，（60．70％）期细胞比例低于TM（87．78％）、Ad。GFP对照组（85．24％）（P〈0．05），Ad—XBP1S实验组ATDC5细胞S期（26．64％）高于TM（6．69％）、Ad—GFP对照组（7．35％）（P〈0．05）；TM刺激诱导ERS条件下，感染Ad—XBP1S腺病毒上清后，ATDC5细胞的凋亡率为7．81％，与TM（33．32％）、Ad—GFP对照组（25．95％）比较，差异具有显著性（P〈0．05）。结论含XBP1S基因的重组腺病毒感染ATDC5细胞后，可加速ATDC5细胞周期的转化并抑制其凋亡。为后续研究XBP1S生物学功能奠定了基础。 展开更多
关键词 X盒结合蛋白1 重组腺病毒 ATDC5细胞 细胞凋亡 增殖
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靶向IRE1a干扰质粒构建及对ERS时细胞增殖及凋亡的影响 被引量：1
5
作者 姜蓉 刘艳娜 +2 位作者 周菁华 刘平 郭风劲 《医学分子生物学杂志》 CAS CSCD 2012年第2期103-109,共7页
目的构建靶向人IRE1a的shRNA干扰质粒（pSUPER-IRE1a）并观察其对人HeLa细胞和HepG2细胞增殖及凋亡的影响。方法设计并合成靶向IRE1a基因的两条shRNA，分别克隆至真核表达载体pSUPER构建重组质粒pS1、pS2，依次转染入HeLa细胞和HepG2细... 目的构建靶向人IRE1a的shRNA干扰质粒（pSUPER-IRE1a）并观察其对人HeLa细胞和HepG2细胞增殖及凋亡的影响。方法设计并合成靶向IRE1a基因的两条shRNA，分别克隆至真核表达载体pSUPER构建重组质粒pS1、pS2，依次转染入HeLa细胞和HepG2细胞中。采用RT—PCR检测pS1、pS2转染前后IRE1a在HeLa细胞和HepG2细胞中的mRNA水平，免疫印迹检测pS1、pS2转染前后IRE1a蛋白的表达；MTT比色法、BrdU／DAPI双免疫荧光法及流式细胞仪分别检测各重组质粒对HeLa细胞和HepG2细胞增殖及凋亡的影响。结果干扰质粒（pSUPER-IRE1a）能有效抑制HeLa细胞和HepG2细胞中IRE1a基因的表达；成功转染后，细胞处于内质网应激（ER stress）状态时，各实验组细胞增殖率及凋亡率与对照组比较，差异均具有统计学意义P〈0．05）。结论成功构建靶向人IRE1a的shRNA真核表达载体pS1、pS2，有效抑制了HeLa细胞和HepG2细胞中IRE1a的表达；细胞处于ERS状态时，IRE1a-shRNA有效促进HeLa、HepG2两种肿瘤细胞的增殖；抑制HeLa和HepG2细胞的凋亡。 展开更多
关键词 IRE1a SHRNA 细胞增殖 细胞凋亡
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