目的:探索胶上蛋白原位酶切、肽质量指纹图(PMF)分析以及数据库检索方法的优化条件,建立适合于亚细胞比较蛋白质组学研究的质谱鉴定策略。方法:从考马斯亮蓝染色的2-DE胶上取下牛血清白蛋白(BSA)标准蛋白进行胶内原位酶切,与基质(CHCA)...目的:探索胶上蛋白原位酶切、肽质量指纹图(PMF)分析以及数据库检索方法的优化条件,建立适合于亚细胞比较蛋白质组学研究的质谱鉴定策略。方法:从考马斯亮蓝染色的2-DE胶上取下牛血清白蛋白(BSA)标准蛋白进行胶内原位酶切,与基质(CHCA)混匀后进行MALDI-TOF MS分析;对来源于人肝细胞癌细胞株QGY-7703线粒体的差异表达的候选蛋白点L9,按照通过BSA标准蛋白优化的条件进行MALDI-TOF质谱鉴定;其肽质量指纹图(PMF)经MS-Fit检索。结果:经数据库检索,BSA的肽质量指纹图(PMF)匹配肽质量数为10/11,序列覆盖率为19%,说明实验条件完全可信。候选蛋白点L9的PMF数据经数据库检索后,排名前两位的蛋白均为OXCT(3-oxoacid CoA transferase 1 precursor),其匹配肽段为9/13,序列覆盖率为24%;且OXCT的理论分子量(56kda),理论等电点(7.1),与胶上L9蛋白的位置相符。故候选蛋白点L9确认为OXCT(3-oxoacid CoA transferase 1 precursor)。结论:本文所确定的鉴定策略适用于线粒体比较蛋白质组学的研究。展开更多
文摘目的:探索胶上蛋白原位酶切、肽质量指纹图(PMF)分析以及数据库检索方法的优化条件,建立适合于亚细胞比较蛋白质组学研究的质谱鉴定策略。方法:从考马斯亮蓝染色的2-DE胶上取下牛血清白蛋白(BSA)标准蛋白进行胶内原位酶切,与基质(CHCA)混匀后进行MALDI-TOF MS分析;对来源于人肝细胞癌细胞株QGY-7703线粒体的差异表达的候选蛋白点L9,按照通过BSA标准蛋白优化的条件进行MALDI-TOF质谱鉴定;其肽质量指纹图(PMF)经MS-Fit检索。结果:经数据库检索,BSA的肽质量指纹图(PMF)匹配肽质量数为10/11,序列覆盖率为19%,说明实验条件完全可信。候选蛋白点L9的PMF数据经数据库检索后,排名前两位的蛋白均为OXCT(3-oxoacid CoA transferase 1 precursor),其匹配肽段为9/13,序列覆盖率为24%;且OXCT的理论分子量(56kda),理论等电点(7.1),与胶上L9蛋白的位置相符。故候选蛋白点L9确认为OXCT(3-oxoacid CoA transferase 1 precursor)。结论:本文所确定的鉴定策略适用于线粒体比较蛋白质组学的研究。
基金This work was supported by the Research Foundation of Chongqing Education Committee (No. KJ070314)Innovation Foundation of Chongqing Medical University (No. CX200526)Research Foundation for Advanced Talents of Chongqing Medical Univer-sity (No. QD200316).
文摘人类X-盒结合蛋白1(X-box binding protein1,XBP1)作为一种重要的转录因子,在细胞中涉及了广泛的信号调控过程。为进一步研究XBP1的生物学功能,首先利用生物信息学技术确定XBP1基因的启动子区域和2个缺失突变体的基因序列,聚合酶链反应扩增XBP1启动子和2个缺失突变体的基因序列,分别克隆至真核报告载体pCAT3-Basic中,构建3个报告载体p1-XBP1p、p2-XBP1p和p3-XBP1p,确定启动子活性最强的序列,并以该序列分别转染正常人肝细胞L02、人肝母细胞瘤细胞HepG2、人肝癌细胞SMMC-7721、人类红白血病细胞K562、人皮肤成纤维细胞HSF和人贮脂细胞Lipocyte Ito Cell 6种不同类型的细胞后(FuGENE 6 transfection reagents),CAT-ELISA方法检测氯霉素乙酰转移酶(CAT)在不同细胞系中的表达活性。每一组CAT结果反应了XBP1启动子转录活性的大小,其中p3-XBP1p在HepG2细胞中活性最强,是pCAT3-Basic的12.4倍,其次是K562和SMMC-7721,分别是10.9倍和10.0倍;在L02细胞中CAT酶活性低于上述3种异常细胞,在HSF和Ito细胞中CAT酶活性低或没有活性。运用适时荧光PCR方法和免疫印迹分别从mRNA水平和蛋白水平检测了XBP1在不同细胞中的表达情况,结果均显示XBP1在HepG2、K562和SMMC-7721细胞中的转录和表达强于L02、HSF和Ito细胞,在HSF细胞和L02细胞中转录和表达较低,在Ito细胞中几乎检测不到XBP1的表达,与CAT-ELISA检测结果一致。因此,XBP1启动子的转录活性在不同细胞中是具有差异的,而XBP1启动子转录活性的大小直接调控下游基因XBP1的表达,导致不同细胞中XBP1的表达丰度也不相同,XBP1启动子的转录活性和表达与细胞类型、细胞周期和组织特异性密切相关。本研究发现XBP1启动子的ATG上游-227bp～66bp区域与XBP1的转录活性密切相关,属于XBP1启动子的核心区域;进一步比较XBP1基因核心启动子区在不同细胞中转录活性的差别和XBP1基因表达丰度的差异,为揭示真核细胞中XBP1的转录调控机制奠定基础。
