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CA-NHEJ系统对大肠杆菌链霉素耐药基因rpsL的编辑效率及其耐药性研究
1
作者 谢钰珍 覃鸿妮 +4 位作者 吴凡 胡杨晓然 薛高旭 赵雪 张勇 《江苏农业科学》 北大核心 2023年第23期17-21,共5页
以控制质粒拷贝数的pcnB基因与链霉素耐药性rpsL基因为靶标基因,研究CA-NHEJ系统对大肠杆菌的基因编辑效率,及rpsL相关基因与链霉素耐药性的关系。通过CA-NHEJ系统成功实现了对大肠杆菌MG1655的pcnB和rpsL基因编辑,其中,pcnB基因编辑效... 以控制质粒拷贝数的pcnB基因与链霉素耐药性rpsL基因为靶标基因,研究CA-NHEJ系统对大肠杆菌的基因编辑效率,及rpsL相关基因与链霉素耐药性的关系。通过CA-NHEJ系统成功实现了对大肠杆菌MG1655的pcnB和rpsL基因编辑,其中,pcnB基因编辑效率达100%,rpsL基因仅有1个克隆缺失第22~24位3个氨基酸,其他4个克隆未编辑成功但具有链霉素抗性;进一步利用CA-HR系统敲除大肠杆菌MG1655的rpsL基因CCTGCGCTG序列(第22~24位氨基酸),编辑效率达100%,验证了CA-HR的高效性,抗性鉴定表明,该序列是影响链霉素抗性的关键序列,是一个未曾报道的新突变;对于未编辑成功但具有链霉素抗性的4个克隆进行基因测序及比对,找出了rhsC和gadB等6个可能与链霉素抗性相关的其他基因。 展开更多
关键词 CA-NHEJ系统 CA-HR系统 RPSL基因 耐药性
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限制性内切酶MluⅠ基因的合成、克隆和初步表达 被引量：1
2
作者 覃鸿妮 钱莉春 +1 位作者 沈晓燕 梅啸 《西南师范大学学报（自然科学版）》 CAS 北大核心 2016年第10期46-53,共8页
在已知基因序列但缺乏DNA模版的情况下,人工设计合成多条引物,采用重叠PCR技术体外人工合成899bp的MluⅠ基因和1 312bp的M.MluⅠ基因.并将合成的MluⅠ基因连接到表达载体pet30a上,重组表达载体构成pet30a-MluⅠ,将M.MluⅠ基因连接到表... 在已知基因序列但缺乏DNA模版的情况下,人工设计合成多条引物,采用重叠PCR技术体外人工合成899bp的MluⅠ基因和1 312bp的M.MluⅠ基因.并将合成的MluⅠ基因连接到表达载体pet30a上,重组表达载体构成pet30a-MluⅠ,将M.MluⅠ基因连接到表达载体PUC19上,重组表达载体构成PUC19-M.MluⅠ.测序结果显示,载体构建成功后利用体外重组转化技术,将pet30a-MluⅠ和PUC19-M.MluⅠ转入T7expression E.coli表达菌株中.重组工程菌经IPTG诱导,用SDS-PAGE鉴定,发现限制性内切酶MluⅠ成功表达.该酶的成功表达不仅为后续研究提供了材料,而且为实验室制备限制性内切酶在方法上开辟了新的途径,为更多新发现的内切酶基因的成功克隆提供了参考. 展开更多
关键词 限制性内切酶 MluⅠ基因的合成 基因克隆 基因表达
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牛胰腺DNaseⅠ基因的合成、表达及功能验证 被引量：1
3
作者 覃鸿妮 谢钰珍 +3 位作者 薛高旭 梅啸 沈为琴 蔡一林 《西南大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2018年第6期24-31,共8页
从NCBI下载牛胰腺DNaseⅠ蛋白序列,利用密码子优化软件(Codon Optimization)进行序列优化,设计并合成24条首尾重叠的引物合成786bp的DNaseⅠ基因,构建重组载体pET30a-DNaseⅠ,转入BL21(DE3),ArcticExpress(DE3),BL21(DE3)pLysS 3种感受... 从NCBI下载牛胰腺DNaseⅠ蛋白序列,利用密码子优化软件(Codon Optimization)进行序列优化,设计并合成24条首尾重叠的引物合成786bp的DNaseⅠ基因,构建重组载体pET30a-DNaseⅠ,转入BL21(DE3),ArcticExpress(DE3),BL21(DE3)pLysS 3种感受态中诱导表达后,纯化目的蛋白并验证其活性.结果表明:BL21(DE3),ArcticExpress(DE3)两种感受态菌落生长异常,且未纯化到目的蛋白,BL21(DE3)pLysS感受态菌落生长正常,但未经诱导和葡萄糖诱导表达的菌液中也未纯化到目的蛋白,IPTG诱导扩大培养的菌液中纯化到0.15 mg/mL的目的蛋白.经验证,酶原液能彻底消化λ-DNA和不同大小的质粒DNA,酶稀释液消化产物电泳检测显示条带拖尾弥散,表明酶稀释液只能消化部分λ-DNA. 展开更多
关键词 DNaseⅠ 基因合成 基因表达 基因功能验证
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利用CRISPR/Cpf1系统构建人ABCG1和ABCG4基因敲除的293T细胞株 被引量：1
4
作者 覃鸿妮 谢钰珍 +1 位作者 马傲 蔡一林 《西南农业学报》 CSCD 北大核心 2019年第4期741-750,共10页
【目的】基于CRISPR/Cpf1(AsCpf1/LbCpf1)技术构建人ABCG1和ABCG4基因敲除的人胚肾细胞(HEK293T)稳定细胞株,旨在研究ABCG1和ABCG4基因的生物学功能。【方法】针对ABCG1和ABCG4基因作用的功能域,设计2对靶向ABCG1和ABCG4基因前7个外显子... 【目的】基于CRISPR/Cpf1(AsCpf1/LbCpf1)技术构建人ABCG1和ABCG4基因敲除的人胚肾细胞(HEK293T)稳定细胞株,旨在研究ABCG1和ABCG4基因的生物学功能。【方法】针对ABCG1和ABCG4基因作用的功能域,设计2对靶向ABCG1和ABCG4基因前7个外显子的sgRNA序列,分别克隆到AsCpf1和LbCpf1的载体上。将测序验证正确的重组质粒转染到HEK293T细胞中,T7E1酶切和测序验证敲除效率,对敲除成功的293T细胞利用有限稀释法筛选获得基因双突变的敲除细胞株,对其基因组进行PCR扩增并双向测序验证编辑结果,选择有正确编辑结果的PCR产物进行TA克隆,进而测序验证单克隆细胞株编辑效率。【结果】结果获得敲除ABCG1和ABCG4基因的稳定细胞株各1株(AsCpf1-ABCG1-sgRNA 1-1和LbCpf1-ABCG4-sgRNA 2-1)。【结论】通过利用新型基因编辑技术CRISPR/Cpf1系统,获得了永久性敲除目的细胞靶基因的细胞株,可为进一步探索和证实ABCG1和ABCG4在细胞中胆固醇代谢和调节作用提供帮助。 展开更多
关键词 CRISPR/Cpf1 ABCG1 ABCG4 基因敲除 稳定细胞株
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慢病毒载体介导稳定表达Cas9基因的293T细胞系构建及其基因编辑效率验证 被引量：1
5
作者 覃鸿妮 谢钰珍 +1 位作者 杨晨晨 张勇 《扬州大学学报（农业与生命科学版）》 CAS 北大核心 2020年第4期29-35,45,共8页
为通过慢病毒感染细胞构建稳定表达CRISPR/Cas9的293T细胞系,实现高效率基因编辑,PCR扩增Cas9基因片段,酶切后克隆到慢病毒载体pLent-EF1a-MF-CMV-GFP-P2A-Puro上,将该质粒与慢病毒包装质粒psPAX2、pMD2.G共感染293FT细胞,48 h后收集病... 为通过慢病毒感染细胞构建稳定表达CRISPR/Cas9的293T细胞系,实现高效率基因编辑,PCR扩增Cas9基因片段,酶切后克隆到慢病毒载体pLent-EF1a-MF-CMV-GFP-P2A-Puro上,将该质粒与慢病毒包装质粒psPAX2、pMD2.G共感染293FT细胞,48 h后收集病毒并浓缩纯化测定其病毒滴度,最后用纯化后的病毒感染293T细胞,通过抗性和荧光标记筛选得到稳定表达Cas9的细胞系,并对单克隆细胞进行DNA、RNA特异性和反转录验证。针对ABCG4基因设计sgRNA并构建重组载体感染单克隆细胞,通过DNA特异性和T7E1酶切验证基因敲除效率。结果表明:成功构建了Cas9-pLent慢病毒载体,用构建成功的慢病毒载体对293FT细胞进行慢病毒包装(三质粒系统)并对包装成功的病毒进行了浓缩与纯化,最后通过病毒感染293T细胞,采用荧光观察的方式测定其病毒滴度均在106 TU·mL-1之上。用纯化后的病毒感染293T细胞并通过加药(Puro)进行抗性筛选,筛选出3株能稳定表达Cas9的293T细胞系,目的基因ABCG4的基因编辑功能验证表明其中1株T7E1酶切掉带明显,sgRNA靶向敲除效率较高,该株命名为Cas9-293T-10A。该研究建立了稳定表达Cas9的293T细胞系,可用于目的基因的高效敲除。 展开更多
关键词 CRISPR/Cas9 慢病毒载体 细胞系 基因编辑
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慢病毒载体介导稳定表达Cpf1的细胞系的构建及其基因编辑效率验证
6
作者 覃鸿妮 谢钰珍 +3 位作者 陈罡 密苗苗 彭赛男 张勇 《西南农业学报》 CSCD 北大核心 2020年第2期246-251,共6页
【目的】通过慢病毒转染细胞构建稳定表达CRISPR/Cpf1的293 T和HT 1080细胞系,实现高效率基因编辑。【方法】PCR扩增AsCpf1和LbCpf1基因片段,酶切后克隆到慢病毒载体pLent-EF1a-MF-CMV-GFP-P2A-Puro上,将该质粒与慢病毒包装质粒psPAX2、... 【目的】通过慢病毒转染细胞构建稳定表达CRISPR/Cpf1的293 T和HT 1080细胞系,实现高效率基因编辑。【方法】PCR扩增AsCpf1和LbCpf1基因片段,酶切后克隆到慢病毒载体pLent-EF1a-MF-CMV-GFP-P2A-Puro上,将该质粒与慢病毒包装质粒psPAX2、pMD2.G共转染293FT细胞,通过抗性和荧光标记筛选得到稳定表达LbCpf1和AsCpf1的细胞系,并对单克隆细胞进行DNA、RNA特异性和反转录验证。用设计好的针对ABCG1基因的sgRNA转染单克隆细胞,通过DNA特异性和T7E1酶切验证基因敲除效率。【结果】成功构建了Cpf1-pLent慢病毒载体,重组载体对293 FT细胞进行慢病毒包装、浓缩与纯化后,病毒滴度均在10~6 TU/mL之上。用纯化后的病毒感染293 T和HT 1080细胞,筛选出3株能稳定表Cpf1的细胞系,目的ABCG1基因的基因编辑功能验证表明其中2株T7EΙ酶切掉带明显,sgRNA靶向敲除效率较高,命名为AsCpf1-293 T-7D和AsCpf1-HT108002-3B。【结论】建立了稳定表达Cpf1的293T和HT 1080细胞细胞系,可以用于目的基因的高效敲除。 展开更多
关键词 CRISPR/Cpf1 慢病毒载体 细胞系 基因编辑
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利用CRISPR/Cas9技术构建能克隆难度序列的Stbl2^(TM)菌株
7
作者 覃鸿妮 谢亦潇 +3 位作者 汤淑伟 薛高旭 谢悦 张勇 《扬州大学学报（农业与生命科学版）》 CAS 北大核心 2022年第5期87-93,100,共8页
Stbl2^(TM)菌株适合克隆不稳定的外源DNA片段,但该菌株易受噬菌体侵染,且在构建某些高拷贝质粒时,难以克隆成功。利用CRISPR/Cas9技术将Stbl2^(TM)菌株的抗噬菌体相关基因fhuA和控制拷贝数的基因pcnB进行编辑,降低克隆难度,提高克隆效... Stbl2^(TM)菌株适合克隆不稳定的外源DNA片段,但该菌株易受噬菌体侵染,且在构建某些高拷贝质粒时,难以克隆成功。利用CRISPR/Cas9技术将Stbl2^(TM)菌株的抗噬菌体相关基因fhuA和控制拷贝数的基因pcnB进行编辑,降低克隆难度,提高克隆效率。针对2个基因分别设计sgRNA,构建含有sgRNA的质粒pTarget-fhuA和pTarget-pcnB,分别将2个质粒与pCas9-Red质粒转入Stbl2^(TM)菌株中,经菌落PCR和测序验证基因正确编辑后再将2个外源质粒消除,并将2 kb的线粒体基因组序列作为外源基因,转入菌株进行最终的功能验证。结果表明:fhuA基因被成功敲除103 bp,pcnB基因被成功敲除802 bp,将高拷贝pUC57质粒转入基因编辑后的Stbl2^(TM)菌株,可明显降低质粒的拷贝数,且能正确克隆线粒体基因难度序列。该研究构建的菌株可作为后续克隆难度序列的感受态使用,还可为难度序列的基因克隆提供借鉴方法。 展开更多
关键词 CRISPR/Cas9技术 Stbl2^(TM)菌株 fhuA基因 pcnB基因
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限制性外切酶Ⅰ(EXO1)的合成、克隆与表达
8
作者 谢钰珍 覃鸿妮 +1 位作者 张勇 赵文玮 《西南农业学报》 CSCD 北大核心 2020年第3期534-539,共6页
【目的】核酸外切酶I(Exonuclease 1,EXO1)是一种多功能的3’→5’外切酶,主要应用于清除DNA或RNA双链分子中存在的单链。目前商品化的EXO1都是在大肠杆菌中诱导表达,表达量不高,且后续纯化步骤复杂。人工合成核酸外切酶I sbcB基因,并... 【目的】核酸外切酶I(Exonuclease 1,EXO1)是一种多功能的3’→5’外切酶,主要应用于清除DNA或RNA双链分子中存在的单链。目前商品化的EXO1都是在大肠杆菌中诱导表达,表达量不高,且后续纯化步骤复杂。人工合成核酸外切酶I sbcB基因,并在大肠杆菌中高效表达及纯化。【方法】采用重叠PCR合成sbcB基因,通过酶切将其克隆至表达载体pET-30a上并转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导,并对表达条件进行优化,获得限制性外切酶Ⅰ(EXO1)的大量表达。亲和层析纯化重组蛋白后对酶的活性进行研究。【结果】亲和纯化后获得大量表达蛋白EXO1,大小与预测的54.5 KD相符;以S1核酸外切酶为对照进行的功能验证证实:sbcB基因表达产物EXO1能够消化单链,但不会消化双链,纯化的EXO1具有很好的酶活性。【结论】依据本文方案制备的限制性外切酶Ⅰ(EXO1)产量高、纯度高,适用于实验室测序前PCR产物的处理。 展开更多
关键词 EXO1 sbcB基因 核酸外切酶 基因表达
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现代学徒制探索与实践——以苏州工业园区服务外包职业学院生命科学系为例 被引量：1
9
作者 覃鸿妮 梅啸 +1 位作者 谢钰珍 张艳 《高教学刊》 2017年第22期83-85,共3页
苏州工业园区服务外包职业学院生命科学系以深入校企合作为基础,通过人才培养模式改革、课程体系构建、实施制度制定等,构建了与地方产业结构相适应的现代学徒制教学体系。通过四年的实践,在教学改革和成果上有所突破,显著提高了学生的... 苏州工业园区服务外包职业学院生命科学系以深入校企合作为基础,通过人才培养模式改革、课程体系构建、实施制度制定等,构建了与地方产业结构相适应的现代学徒制教学体系。通过四年的实践,在教学改革和成果上有所突破,显著提高了学生的实习和就业质量,深化了校企合作机制,增强了专业的社会服务能力,并极大地提高了师资水平。 展开更多
关键词 现代学徒制 生命科学系 人才培养
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关于新时期企业管理的创新思考探讨 被引量：1
10
作者 林立 《商场现代化》 2016年第19期74-75,共2页
在经济全球化的大背景下,企业的发展日新月异,随之而来,企业的管理也必须要适应时代的发展和需求,不断的进行改革和创新。作为企业来讲,想要获得长远发展,必须接受创新理念,创新公司的经营方式,只有科学的对企业进行管理创新,才能够让... 在经济全球化的大背景下,企业的发展日新月异,随之而来,企业的管理也必须要适应时代的发展和需求,不断的进行改革和创新。作为企业来讲,想要获得长远发展,必须接受创新理念,创新公司的经营方式,只有科学的对企业进行管理创新,才能够让企业在日益竞争的市场环境下获得一席之地。本文就是针对在新时期时代背景下,企业如何进行管理创新展开思考和探究。 展开更多
关键词 新时期 企业 管理 创新 思考
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