目的通过慢病毒介导环氧合酶2（cyclooxygenase 2,COX-2）-si RNA、聚蛋白多糖酶1（Aggrecanase-1）-si RNA、IGF-1基因联合转染BMSCs,将其注射至食蟹猴骨关节炎（osteoarthritis,OA）模型关节腔,探讨对OA相关炎性因子及关节软骨的影响...目的通过慢病毒介导环氧合酶2（cyclooxygenase 2,COX-2）-si RNA、聚蛋白多糖酶1（Aggrecanase-1）-si RNA、IGF-1基因联合转染BMSCs,将其注射至食蟹猴骨关节炎（osteoarthritis,OA）模型关节腔,探讨对OA相关炎性因子及关节软骨的影响。方法取髋关节OA患者自愿捐赠骨髓组织,分离培养BMSCs。采用基因重组技术构建COX-2-si RNA、Aggrecanase-1-si RNA和IGF-1过表达基因的慢病毒载体,以最佳感染复数40转染第3代BMSCs（病毒组）,以空慢病毒转染培养作为对照（空病毒组）,以正常BMSCs作为正常对照组。倒置相差显微镜下观察细胞生长状态,并行细胞计数;取转染培养1周细胞,RT-PCR检测COX-2、Aggrecanase-1及IGF-1 m RNA的表达。取健康3岁食蟹猴9只,按照Hulth造模法于右膝制备OA模型后,随机分为3组（n=3）。模型制备术后6周,病毒组及空病毒组右膝关节腔内分别注射对应的1 m L BMSCs（约1×10~7个）,空白对照组注射1 m L生理盐水。以左膝作为正常对照组。注射后观察动物一般情况;1、4、6周取双膝关节液,ELISA检测前列腺素E2（prostaglandin E2,PGE2）、IL-1、Aggrecanase-1、IGF-1浓度;6周时MRI及大体观察检查膝关节软骨改变,并取材行组织学、免疫组织化学染色观察,以及RT-PCR检测COX-2、Aggrecanase-1及IGF-1 m RNA表达。结果转染后两组细胞形态及生长曲线无明显差异。RT-RCR检测,与空病毒组、正常对照组比较,病毒组COX-2、Aggrecanase-1表达明显降低,IGF-1表达明显增加（P〈0.05）。细胞注射后各组动物均存活至实验完成。注射后1、4、6周,病毒组PGE2、Aggrecanase-1、IL-1浓度明显低于空病毒组、空白对照组,但IGF-1浓度明显增高（P〈0.05）;但3组以上指标浓度均显著高于正常对照组（P〈0.05）。MRI检查示,与正常对照组比较,病毒组、空病毒组及空白对照组关节面均出现异常高密度影,但病毒组区域最小。大体观察及组织学观察见,病毒组、空病毒组及空白对照组关节软骨符合早期OA改变,但病毒组修复程度优于空病毒组及空白对照组,根据改良Pineda评分标准的组织学评分亦较低,比较差异均有统计学意义（P〈0.05）。免疫组织化学染色示,病毒组细胞质染色较空病毒组及空白对照组深,偶尔可见棕黄色颗粒,软骨细胞较多。RT-PCR检测,与空病毒和空白对照组相比,病毒组COX-2、Aggrecanase-1 m RNA表达明显降低,IGF-1 m RNA表达明显增高（P〈0.05）。结论慢病毒介导的多基因转染BMSCs可以有效抑制食蟹猴早期OA模型膝关节腔内COX-2和Aggrecanse-1的表达,增强IGF-1的表达,降低膝关节内炎性因子浓度,有效保护关节软骨。展开更多
文摘目的通过慢病毒介导环氧合酶2（cyclooxygenase 2,COX-2）-si RNA、聚蛋白多糖酶1（Aggrecanase-1）-si RNA、IGF-1基因联合转染BMSCs,将其注射至食蟹猴骨关节炎（osteoarthritis,OA）模型关节腔,探讨对OA相关炎性因子及关节软骨的影响。方法取髋关节OA患者自愿捐赠骨髓组织,分离培养BMSCs。采用基因重组技术构建COX-2-si RNA、Aggrecanase-1-si RNA和IGF-1过表达基因的慢病毒载体,以最佳感染复数40转染第3代BMSCs（病毒组）,以空慢病毒转染培养作为对照（空病毒组）,以正常BMSCs作为正常对照组。倒置相差显微镜下观察细胞生长状态,并行细胞计数;取转染培养1周细胞,RT-PCR检测COX-2、Aggrecanase-1及IGF-1 m RNA的表达。取健康3岁食蟹猴9只,按照Hulth造模法于右膝制备OA模型后,随机分为3组（n=3）。模型制备术后6周,病毒组及空病毒组右膝关节腔内分别注射对应的1 m L BMSCs（约1×10~7个）,空白对照组注射1 m L生理盐水。以左膝作为正常对照组。注射后观察动物一般情况;1、4、6周取双膝关节液,ELISA检测前列腺素E2（prostaglandin E2,PGE2）、IL-1、Aggrecanase-1、IGF-1浓度;6周时MRI及大体观察检查膝关节软骨改变,并取材行组织学、免疫组织化学染色观察,以及RT-PCR检测COX-2、Aggrecanase-1及IGF-1 m RNA表达。结果转染后两组细胞形态及生长曲线无明显差异。RT-RCR检测,与空病毒组、正常对照组比较,病毒组COX-2、Aggrecanase-1表达明显降低,IGF-1表达明显增加（P〈0.05）。细胞注射后各组动物均存活至实验完成。注射后1、4、6周,病毒组PGE2、Aggrecanase-1、IL-1浓度明显低于空病毒组、空白对照组,但IGF-1浓度明显增高（P〈0.05）;但3组以上指标浓度均显著高于正常对照组（P〈0.05）。MRI检查示,与正常对照组比较,病毒组、空病毒组及空白对照组关节面均出现异常高密度影,但病毒组区域最小。大体观察及组织学观察见,病毒组、空病毒组及空白对照组关节软骨符合早期OA改变,但病毒组修复程度优于空病毒组及空白对照组,根据改良Pineda评分标准的组织学评分亦较低,比较差异均有统计学意义（P〈0.05）。免疫组织化学染色示,病毒组细胞质染色较空病毒组及空白对照组深,偶尔可见棕黄色颗粒,软骨细胞较多。RT-PCR检测,与空病毒和空白对照组相比,病毒组COX-2、Aggrecanase-1 m RNA表达明显降低,IGF-1 m RNA表达明显增高（P〈0.05）。结论慢病毒介导的多基因转染BMSCs可以有效抑制食蟹猴早期OA模型膝关节腔内COX-2和Aggrecanse-1的表达,增强IGF-1的表达,降低膝关节内炎性因子浓度,有效保护关节软骨。
